B2 · Enzymologie

Cinétique michaélienne : Km, Vmax et représentations graphiques

Établir le modèle de Michaelis-Menten, ses hypothèses et la signification de Km, Vmax et de la constante catalytique. Exploiter la représentation hyperbolique et sa linéarisation pour déterminer les paramètres cinétiques.

Biochimie structurale et métabolique5 min de lecture12 QCM corrigés

Schéma cinétique d'une enzyme michaélienne

La catalyse enzymatique et le rôle du site actif sont étudiés dans la fiche précédente. Ici, l'enzyme est décrite par un modèle cinétique simple reliant la vitesse initiale à la concentration en substrat.

Pour une enzyme $E$ , un substrat $S$ , un complexe enzyme-substrat $ES$ et un produit $P$ , le mécanisme minimal est :

\ce{E + S <=>[k_1][k_{-1}] ES ->[k_{cat}] E + P}

$k_1$ : constante de vitesse d'association de $E$ et $S$ , en concentration $^{-1}$ ·temps $^{-1}$
$k_{-1}$ : constante de vitesse de dissociation de $ES$ vers $E+S$ , en temps $^{-1}$
$k_{\mathrm{cat}}$ : constante catalytique de transformation de $ES$ en $E+P$ , en temps $^{-1}$

L'enzyme est régénérée à la fin du cycle : elle n'est pas consommée. La vitesse initiale dépend directement de la concentration du complexe $ES$ :

v_0 = k_{\mathrm{cat}}[ES]

La difficulté consiste donc à exprimer $[ES]$ à partir de la concentration en substrat $[S]$ et de la concentration enzymatique totale $[E]_T$ .

Hypothèses du modèle

L'équation de Michaelis-Menten repose sur plusieurs conditions.

La réaction est étudiée à son début, de sorte que $[P]$ est négligeable et que la réaction inverse à partir du produit peut être ignorée.
Le substrat est en large excès par rapport à l'enzyme : $[S] \gg [E]_T$ . Sa concentration varie donc peu pendant la mesure de $v_0$ .
La concentration totale en enzyme est conservée :

[E]_T = [E] + [ES]

Après une phase transitoire très courte, le complexe $ES$ est en état quasi stationnaire : sa vitesse de formation est égale à sa vitesse de disparition.
L'enzyme suit un comportement michaélien simple, sans coopérativité ni régulation allostérique.

La condition d'état quasi stationnaire s'écrit :

\frac{\mathrm{d}[ES]}{\mathrm{d}t} = k_1[E][S]-(k_{-1}+k_{\mathrm{cat}})[ES] \simeq 0

En utilisant $[E]=[E]_T-[ES]$ puis en réarrangeant l'expression, on obtient :

[ES]=\frac{[E]_T[S]}{K_m+[S]}

Constante de Michaelis et vitesse maximale

La substitution de l'expression de $[ES]$ dans $v_0=k_{\mathrm{cat}}[ES]$ fait apparaître la vitesse maximale.

On obtient alors l'équation fondamentale.

Exemple

Calculer une vitesse initiale avec l’équation de Michaelis-Menten

Pour une enzyme, $V_{\max}=\pu{120 \mu mol.min^{-1}}$ et $K_m=\pu{2 mmol.L^{-1}}$ . La vitesse initiale est recherchée pour $[S]=\pu{6 mmol.L^{-1}}$ .

v_0=\frac{V_{\max}[S]}{K_m+[S]} =\frac{120\times 6}{2+6} =\pu{90 \mu mol.min^{-1}}

La vitesse initiale vaut donc $\pu{90 \mu mol.min^{-1}}$ , soit $75 \%$ de $V_{\max}$ . La concentration en substrat est supérieure à $K_m$ , mais l’enzyme n’est pas encore totalement saturée.

Lorsque $[S]=K_m$ , l'équation donne :

v_0=\frac{V_{\max}}{2}

Ainsi, $K_m$ est la concentration en substrat pour laquelle la vitesse initiale atteint la moitié de la vitesse maximale.

Constante catalytique et efficacité catalytique

Elle se déduit de la vitesse maximale si la concentration totale en sites actifs est connue :

k_{\mathrm{cat}}=\frac{V_{\max}}{[E]_T}

Contrairement à $V_{\max}$ , $k_{\mathrm{cat}}$ est une propriété intrinsèque du couple enzyme-substrat dans des conditions physicochimiques déterminées. En effet, augmenter la quantité d'enzyme augmente $V_{\max}$ mais ne modifie pas le fonctionnement d'un site actif individuel.

Le rapport $k_{\mathrm{cat}}/K_m$ caractérise l'efficacité catalytique lorsque le substrat est peu concentré. Dans ce domaine, $[S]\ll K_m$ , donc :

v_0\simeq\frac{k_{\mathrm{cat}}}{K_m}[E]_T[S]

Représentation hyperbolique

La représentation de $v_0$ en fonction de $[S]$ est une hyperbole de saturation.

Domaine des faibles concentrations

Lorsque $[S]\ll K_m$ , le terme $K_m+[S]$ est approximativement égal à $K_m$ :

v_0\simeq\frac{V_{\max}}{K_m}[S]

La vitesse est alors presque proportionnelle à la concentration en substrat. La pente initiale de la courbe vaut $V_{\max}/K_m$ .

Domaine de saturation

Lorsque $[S]\gg K_m$ , le terme $K_m+[S]$ est approximativement égal à $[S]$ :

v_0\simeq V_{\max}

La majorité des sites actifs est occupée. Ajouter du substrat augmente très peu la concentration de $ES$ et donc très peu la vitesse. $V_{\max}$ constitue l'asymptote horizontale de la courbe.

Détermination graphique

Cette lecture directe reste approximative, car l'asymptote peut être difficile à situer précisément.

Représentation de Lineweaver-Burk

La représentation de Lineweaver-Burk transforme l'hyperbole en droite en prenant l'inverse des deux membres de l'équation de Michaelis-Menten.

Cette relation a la forme d'une droite $y=ax+b$ :

ordonnée : $y=1/v_0$ ;
abscisse : $x=1/[S]$ ;
pente : $a=K_m/V_{\max}$ ;
ordonnée à l'origine : $b=1/V_{\max}$ ;
abscisse à l'origine : $-1/K_m$ .

Comparaison

Lecture des représentations cinétiques

Critère	Représentation hyperbolique	Représentation de Lineweaver-Burk
Abscisse	$[S]$	$1/[S]$
Ordonnée	$v_0$	$1/v_0$
Détermination de $V_{\max}$	asymptote horizontale	inverse de l'ordonnée à l'origine
Détermination de $K_m$	abscisse pour $V_{\max}/2$	opposé de l'inverse de l'abscisse à l'origine
Forme	hyperbole	droite

Les effets des inhibiteurs sur la pente et les intersections de cette droite relèvent de la fiche consacrée aux inhibitions enzymatiques.

Points clés

Le modèle repose sur la mesure d'une vitesse initiale, un substrat en excès et un état quasi stationnaire du complexe $ES$
L'équation michaélienne est $v_0=V_{\max}[S]/(K_m+[S])$
$K_m$ est la concentration en substrat donnant la demi-vitesse maximale, sans être nécessairement une mesure directe de l'affinité
$V_{\max}=k_{\mathrm{cat}}[E]_T$ , tandis que $k_{\mathrm{cat}}$ décrit l'activité maximale d'un site actif
La courbe $v_0$ en fonction de $[S]$ est hyperbolique et tend vers $V_{\max}$ à saturation
La représentation de Lineweaver-Burk est une droite de pente $K_m/V_{\max}$ et d'ordonnée à l'origine $1/V_{\max}$

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