B3 · Méthodes
Clonage, vecteurs et ADN recombinant
Décrire la construction d'un ADN recombinant, les vecteurs de clonage et d'expression et la sélection des clones. Présenter la production de protéines recombinantes et ses applications médicales.
Biologie moléculaire et génome7 min de lecture17 QCM corrigés
Principe du clonage moléculaire
Le clonage moléculaire consiste à introduire un fragment d'ADN déterminé dans une molécule capable de se maintenir dans une cellule hôte. Après multiplication de cette cellule, toutes ses descendantes portent en principe la même construction génétique.
Le fragment que l'on souhaite cloner est appelé insert. La molécule d'ADN qui le reçoit est le vecteur. Leur association forme la construction recombinante. Le clonage permet soit de multiplier l'insert, soit de provoquer son expression afin de produire un ARN ou une protéine.
Construction d'un ADN recombinant
Obtention de l'insert
L'insert peut être isolé à partir d'un ADN génomique, obtenu sous forme d'ADN complémentaire ou amplifié à partir d'un ADN matrice. Les principes de l'amplification par PCR relèvent de la fiche consacrée à cette méthode.
L'ADNc est particulièrement adapté à la production d'une protéine eucaryote dans une cellule procaryote, car celle-ci ne possède généralement pas la machinerie nécessaire pour retirer les introns d'un gène eucaryote.
Ouverture du vecteur et préparation de l'insert
Une endonucléase de restriction reconnaît une courte séquence particulière de l'ADN et coupe les liaisons phosphodiester des deux brins. La coupure peut former :
- des extrémités franches, sans région simple brin saillante ;
- des extrémités cohésives, portant de courtes séquences à simple brin complémentaires.
Les extrémités cohésives s'apparient spontanément lorsqu'elles sont complémentaires, ce qui facilite et rend plus spécifique l’assemblage. L'utilisation de deux enzymes différentes peut imposer l'orientation de l'insert : chaque extrémité ne devient compatible qu'avec une extrémité déterminée du vecteur.
L'appariement des bases maintient temporairement les fragments ensemble, mais seule la ligase rend leur union covalente et durable. D'autres stratégies d'assemblage utilisent des régions homologues entre fragments ; leur objectif reste identique : obtenir une molécule continue dans l'orientation et le cadre de lecture souhaités.
Orientation et cadre de lecture
Pour une simple multiplication de l'ADN, l'orientation de l'insert peut parfois être secondaire. Pour produire une protéine, elle est indispensable : la séquence codante doit être placée dans le sens de transcription imposé par le promoteur.
Le cadre de lecture correspond au découpage de la séquence codante en triplets successifs. Toute jonction incorrecte peut décaler ce cadre et modifier l'ensemble de la séquence protéique située en aval.
Vecteurs de clonage et vecteurs d'expression
Propriétés d'un vecteur
Un vecteur de clonage comporte au minimum :
- une origine de réplication, séquence permettant sa duplication dans l'hôte ;
- un marqueur de sélection, caractère génétique permettant d'identifier les cellules ayant acquis le vecteur ;
- une région contenant des sites de restriction utilisables pour insérer l'ADN ;
- une structure compatible avec la cellule hôte choisie.
Le plasmide est une molécule d'ADN généralement circulaire, distincte du chromosome cellulaire et capable de réplication autonome. Sa petite taille facilite sa purification et sa manipulation. Pour des inserts plus longs, des vecteurs dérivés de virus ou de chromosomes artificiels peuvent être employés.
Exprimer une séquence clonée
Un vecteur d'expression comprend notamment :
- un promoteur, sur lequel s'assemble la machinerie de transcription ;
- une séquence permettant l'arrêt correct de la transcription ;
- un signal d'initiation de la traduction reconnu par l'hôte ;
- éventuellement un signal d'adressage ou de sécrétion ;
- éventuellement une séquence codant une étiquette facilitant la purification ou la détection de la protéine.
Le promoteur peut être constitutif ou inductible. Un promoteur inductible permet de déclencher l'expression à un moment choisi, ce qui limite les effets toxiques d'une production permanente et sépare la phase de multiplication cellulaire de la phase de production.
Introduction dans la cellule et sélection des clones
L'entrée d'un ADN exogène dans une cellule bactérienne est appelée transformation. Pour les cellules eucaryotes, le terme transfection est couramment utilisé lorsque l'ADN est introduit par une méthode non virale. Une cellule ayant reçu le vecteur est dite transformée ou transfectée selon le contexte.
Après cette étape, plusieurs populations peuvent coexister : cellules sans vecteur, cellules portant un vecteur refermé sans insert et cellules portant le recombinant attendu.
Le marqueur de sélection élimine les cellules dépourvues de vecteur, mais ne prouve pas que celui-ci contient le bon insert. Le criblage peut reposer sur un phénotype rapporteur, une amplification ciblée, une digestion de contrôle ou une hybridation avec une sonde. La confirmation définitive de la séquence et des jonctions repose sur le séquençage, présenté dans la fiche dédiée.
Production de protéines recombinantes
La production commence par le choix de l'hôte. Les cellules procaryotes se multiplient rapidement et donnent des rendements élevés, mais réalisent difficilement certaines modifications post-traductionnelles. Les cellules eucaryotes permettent un repliement, une maturation et une glycosylation plus proches de ceux des protéines humaines, au prix d'une culture plus complexe.
La construction validée est introduite dans l'hôte, puis les cellules productrices sont cultivées. L'expression est déclenchée si le promoteur est inductible. La protéine est ensuite récupérée dans les cellules ou dans le milieu lorsqu'elle est sécrétée, puis purifiée. Son identité, sa pureté, sa structure et son activité biologique doivent être contrôlées.
Les protéines recombinantes ont des applications médicales majeures :
- production de protéines thérapeutiques remplaçant ou modulant une fonction biologique ;
- fabrication d'anticorps et d'autres molécules de ciblage ;
- production d'antigènes destinés aux vaccins ;
- préparation de réactifs enzymatiques ou antigéniques pour le diagnostic ;
- étude de protéines impliquées dans les maladies et recherche de cibles thérapeutiques.
La qualité ne dépend donc pas seulement de la séquence d'ADN. Le système d'expression doit aussi assurer une maturation correcte, limiter les contaminants issus de l'hôte et permettre une production reproductible.
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