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Sommaire

  • 1Principe de l'électrophorèse des acides nucléiques
    • 1.1Nature du gel
    • 1.2Révélation et détermination de la taille
  • 2Endonucléases de restriction et production de fragments
  • 3Principe du transfert sur membrane lock — section verrouillée
  • 4Transferts de Southern, Northern et Western lock — section verrouillée
    • 4.1Transfert de Southern pour l'ADN lock — section verrouillée
    • 4.2Transfert de Northern pour l'ARN lock — section verrouillée
    • 4.3Transfert de Western pour les protéines lock — section verrouillée
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  5. Électrophorèse des acides nucléiques et techniques de transfert

B3 · Méthodes

Électrophorèse des acides nucléiques et techniques de transfert

Décrire la séparation des acides nucléiques selon leur taille et l'usage des endonucléases de restriction. Présenter les techniques d'hybridation sur membrane pour l'ADN, l'ARN et les protéines.

Biologie moléculaire et génome·schedule7 min de lecture·quiz17 QCM corrigés

Principe de l'électrophorèse des acides nucléiques

Définition

Électrophorèse

Technique de séparation de molécules chargées reposant sur leur déplacement dans un champ électrique au sein d'un support poreux.

L'ADN et l'ARN portent des groupements phosphate négativement chargés. Lorsqu'un champ électrique est appliqué, ils migrent donc de la cathode négative vers l'anode positive.

Le support est généralement un gel, c'est-à-dire un réseau tridimensionnel contenant des pores. Ce réseau exerce un effet de tamis moléculaire : les petites molécules traversent plus facilement les pores et migrent plus rapidement que les grandes. Pour des fragments linéaires d'ADN de même nature, le rapport entre charge électrique et masse varie peu. La séparation dépend donc principalement de leur taille, exprimée en nombre de paires de bases pour l'ADN bicaténaire ou en nombre de nucléotides pour l'ARN.

Formule

Vitesse de migration électrophorétique

v=μEv = \mu Ev=μE
  • vvv : vitesse de migration de la molécule
  • μ\muμ : mobilité électrophorétique de la molécule dans les conditions considérées
  • EEE : intensité du champ électrique

La mobilité μ\muμ dépend notamment de la taille de la molécule, de sa conformation, de la porosité du gel, de la composition du tampon et de la température. La migration n'est donc pas déterminée par la taille seule lorsque les molécules n'ont pas la même structure.

Nature du gel

Comparaison

Principaux supports d'électrophorèse

CritèreGel d'agaroseGel de polyacrylamide
Porositépores relativement largespores fins et réglables
Fragments privilégiésfragments moyens à grandsfragments courts
Pouvoir de résolutionmodéréélevé
Usage dominantséparation courante de l'ADN et de l'ARNséparation fine de fragments proches en taille

La concentration du gel règle sa porosité. Une concentration élevée produit des pores plus petits et améliore la séparation des fragments courts. Une concentration faible facilite au contraire la migration des fragments longs.

L'électrophorèse peut être réalisée en conditions natives, qui conservent autant que possible la conformation des molécules, ou en conditions dénaturantes, qui détruisent les appariements et les structures secondaires. Ces dernières sont particulièrement utiles pour l'ARN, dont le repliement peut modifier fortement la migration.

Attention

Taille et distance de migration

Dans un gel donné, les fragments les plus courts migrent généralement le plus loin. Cependant, deux molécules de même taille mais de conformations différentes peuvent présenter des mobilités distinctes.

Révélation et détermination de la taille

Après migration, les acides nucléiques sont révélés par un marquage fluorescent ou par une autre méthode de détection adaptée. Chaque population de fragments de taille voisine forme une bande.

Définition

Marqueur de taille

Mélange de fragments dont les tailles sont connues, déposé sur le même gel que les échantillons afin d'estimer la taille des bandes observées.

L'intensité d'une bande dépend de la quantité de matière détectée, mais elle ne constitue une mesure quantitative fiable que si le signal reste proportionnel à cette quantité et si les conditions de dépôt et de révélation sont maîtrisées.

Endonucléases de restriction et production de fragments

Définition

Endonucléase de restriction

Enzyme bactérienne qui reconnaît une séquence déterminée d'ADN bicaténaire et coupe les liaisons phosphodiester à l'intérieur ou à proximité de cette séquence.

La séquence reconnue constitue un site de restriction. Elle présente souvent une symétrie dite palindromique : la lecture de chaque brin dans le sens 5′→3′5' \rightarrow 3'5′→3′ donne la même succession de bases. Une même enzyme coupe donc l'ADN de manière reproductible à tous ses sites accessibles.

Exemple

Clivage reproductible d'un site de restriction par EcoRI

L'endonucléase EcoRI reconnaît le site suivant :

5′−GAATTC−3′3′−CTTAAG−5′\begin{aligned} 5' - \mathrm{GAATTC} - 3' \\ 3' - \mathrm{CTTAAG} - 5' \end{aligned}5′−GAATTC−3′3′−CTTAAG−5′​

Le brin inférieur, lu dans le sens 5′→3′5' \rightarrow 3'5′→3′, porte lui aussi la séquence GAATTC\mathrm{GAATTC}GAATTC. Le site est donc palindromique.

EcoRI coupe toujours entre G\mathrm{G}G et A\mathrm{A}A sur chacun des deux brins :

5′−G∣AATTC−3′3′−CTTAA∣G−5′\begin{aligned} 5' - \mathrm{G}\mathbin{|}\mathrm{AATTC} - 3' \\ 3' - \mathrm{CTTAA}\mathbin{|}\mathrm{G} - 5' \end{aligned}5′−G∣AATTC−3′3′−CTTAA∣G−5′​

Le même site présent à plusieurs positions d'une molécule d'ADN est clivé de la même manière. La digestion produit ainsi des fragments reproductibles, portant des extrémités cohésives à surplomb 5′5'5′ de séquence AATT\mathrm{AATT}AATT.

La coupure peut produire :

  • des extrémités franches, lorsque les deux brins sont coupés au même niveau ;
  • des extrémités cohésives, lorsque les coupures sont décalées et laissent de courtes régions simple brin complémentaires.

Les applications au clonage et à la construction d'ADN recombinant sont développées dans la fiche consacrée aux vecteurs ; ici, la digestion sert surtout à transformer une longue molécule d'ADN en fragments séparables par électrophorèse.

Définition

Profil de restriction

Ensemble des fragments obtenus après digestion d'un ADN par une ou plusieurs endonucléases de restriction, caractérisé par le nombre et la taille des bandes après électrophorèse.

Une digestion complète suppose que tous les sites reconnus ont été coupés. Une digestion partielle laisse subsister des molécules dans lesquelles certains sites n'ont pas été clivés, ce qui produit des fragments supplémentaires et complique l'interprétation.

Méthode

Analyser des fragments issus d'une digestion de restriction

  1. Choisir l'endonucléase selon les sites de restriction recherchés
  2. Incuber l'ADN avec l'enzyme dans un tampon compatible
  3. Déposer les produits de digestion dans un gel adapté à leur taille attendue
  4. Appliquer le champ électrique jusqu'à obtenir une séparation suffisante
  5. Révéler les bandes et comparer leur migration à celle d'un marqueur de taille
  6. Interpréter le nombre et la taille des fragments obtenus
À retenir

L'électrophorèse sépare les fragments, mais n'identifie pas à elle seule leur séquence. L'identification spécifique d'un fragment nécessite une sonde complémentaire ou une autre méthode d'analyse moléculaire.

Principe du transfert sur membrane

Après électrophorèse, les molécules restent dispersées dans un gel fragile et difficile à manipuler. Le transfert sur membrane les déplace vers une membrane solide tout en conservant leur position relative. La membrane, généralement en nylon ou en matériau polymérique, facilite leur immobilisation, leur exposition à un réactif spécifique et leur détection.

Le transfert peut reposer sur la capillarité, une différence de pression ou un champ électrique. Une fois les molécules immobilisées, une étape de reconnaissance spécifique révèle uniquement la cible recherchée.

Définition

Sonde nucléique

Fragment d'ADN ou d'ARN simple brin, marqué et de séquence connue, capable de s'apparier spécifiquement avec une séquence complémentaire immobilisée.

Définition

Hybridation moléculaire

Association de deux brins d'acides nucléiques complémentaires par formation de liaisons hydrogène entre leurs bases.

Après hybridation, des lavages éliminent les sondes non fixées ou insuffisamment appariées. La stringence correspond au degré d'exigence imposé à l'appariement. Une température élevée, une faible concentration ionique ou des lavages plus rigoureux favorisent la conservation des appariements les plus complémentaires.

Transferts de Southern, Northern et Western

Transfert de Southern pour l'ADN

Le transfert de Southern détecte une séquence d'ADN déterminée parmi les fragments séparés par électrophorèse.

Méthode

Étapes du transfert de Southern

  1. Digérer éventuellement l'ADN par des endonucléases de restriction
  2. Séparer les fragments d'ADN par électrophorèse
  3. Dénaturer l'ADN bicaténaire afin d'obtenir des brins simples
  4. Transférer les fragments du gel vers une membrane
  5. Immobiliser l'ADN sur la membrane
  6. Incuber la membrane avec une sonde marquée complémentaire de la séquence recherchée
  7. Laver la membrane puis détecter le signal associé à la sonde

La position du signal renseigne sur la taille du fragment portant la séquence recherchée. Son intensité dépend de la quantité de cible, de l'efficacité du transfert et des conditions d'hybridation.

Transfert de Northern pour l'ARN

Le transfert de Northern applique le même principe général à l'ARN. Les ARN sont habituellement séparés dans des conditions dénaturantes afin que leur migration dépende principalement de leur longueur plutôt que de leurs structures secondaires.

Après transfert et immobilisation, une sonde complémentaire révèle un ARN déterminé. La position de la bande renseigne sur la taille du transcrit, tandis que son intensité peut informer sur son abondance relative si les dépôts et les contrôles sont comparables.

Transfert de Western pour les protéines

Le transfert de Western concerne les protéines, et non les acides nucléiques. Les protéines sont d'abord séparées selon leur masse moléculaire apparente par électrophorèse en gel de polyacrylamide en présence d'un détergent dénaturant. Elles sont ensuite transférées sur une membrane.

La détection repose sur un anticorps primaire reconnaissant la protéine cible. Un anticorps secondaire marqué peut ensuite reconnaître l'anticorps primaire et amplifier le signal.

Attention

Hybridation et reconnaissance immunologique

Les transferts de Southern et de Northern utilisent l'hybridation entre séquences nucléiques complémentaires. Le transfert de Western utilise une reconnaissance entre un antigène protéique et un anticorps : il ne s'agit pas d'une hybridation d'acides nucléiques.

Comparaison

Techniques de transfert

CritèreSouthernNorthernWestern
Molécule analyséeADNARNprotéine
Séparation initialeélectrophorèse d'ADNélectrophorèse dénaturante d'ARNélectrophorèse de protéines
Réactif de détectionsonde nucléique complémentairesonde nucléique complémentaireanticorps spécifique
Information principaleprésence et taille d'un fragment portant une séquencetaille et abondance relative d'un transcritprésence et masse apparente d'une protéine
À retenir

Southern correspond à l'ADN, Northern à l'ARN et Western aux protéines. Les deux premiers reposent sur la complémentarité des bases ; le troisième repose sur la reconnaissance immunologique.

Points clés
  • L'ADN et l'ARN, chargés négativement, migrent vers l'anode au cours de l'électrophorèse
  • Le gel agit comme un tamis : les fragments courts migrent généralement plus vite et plus loin que les fragments longs
  • Les endonucléases de restriction coupent l'ADN à des sites déterminés et produisent des fragments séparables
  • Le transfert sur membrane conserve la disposition des molécules séparées et permet leur détection spécifique
  • Southern détecte l'ADN, Northern détecte l'ARN et Western détecte les protéines
  • Une sonde nucléique reconnaît une séquence complémentaire, tandis qu'un anticorps reconnaît une cible protéique

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    • 1.2Révélation et détermination de la taille
  • 2Endonucléases de restriction et production de fragments
  • 3Principe du transfert sur membrane lock — section verrouillée
  • 4Transferts de Southern, Northern et Western lock — section verrouillée
    • 4.1Transfert de Southern pour l'ADN lock — section verrouillée
    • 4.2Transfert de Northern pour l'ARN lock — section verrouillée
    • 4.3Transfert de Western pour les protéines lock — section verrouillée