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Sommaire

  • 1Principe général de la PCR
    • 1.1Rôle des amorces
    • 1.2Rôle de la polymérase thermostable
  • 2Les trois étapes d’un cycle
  • 3Rétrotranscription et RT-PCR
  • 4PCR quantitative en temps réel lock — section verrouillée
    • 4.1Cycle de quantification lock — section verrouillée
    • 4.2Quantification absolue et relative lock — section verrouillée
  • 5Applications diagnostiques et contrôles lock — section verrouillée
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B3 · Méthodes

PCR, RT-PCR et PCR quantitative

Décrire le principe des cycles de dénaturation, hybridation et élongation, le rôle des amorces et de la polymérase thermostable. Présenter la rétrotranscription et la quantification en temps réel, et les applications diagnostiques.

Biologie moléculaire et génome·schedule7 min de lecture·quiz17 QCM corrigés

Principe général de la PCR

Définition

Réaction de polymérisation en chaîne ou PCR

Technique d’amplification sélective, réalisée hors de la cellule, d’une région d’ADN délimitée par deux amorces. La répétition de cycles thermiques produit un grand nombre de copies de cette région.

La région amplifiée est appelée amplicon. La PCR ne copie donc pas tout l’ADN présent dans l’échantillon : elle amplifie uniquement la séquence située entre les deux amorces, à condition que celles-ci puissent s’y fixer.

Le mélange réactionnel contient :

  • un ADN matrice, qui porte la séquence recherchée ;
  • deux amorces, courtes oligonucléotides complémentaires des séquences bordant la région cible ;
  • des désoxyribonucléotides triphosphates, notés dATP, dTTP, dCTP et dGTP, qui constituent les unités incorporées dans l’ADN ;
  • une ADN polymérase thermostable, qui synthétise les nouveaux brins ;
  • des ions magnésium et une solution tampon assurant les conditions chimiques nécessaires.

Rôle des amorces

Définition

Amorce

Court fragment d’ADN simple brin capable de s’hybrider à une séquence complémentaire de l’ADN matrice et de fournir une extrémité 3′-OH3'\text{-OH}3′-OH à partir de laquelle l’ADN polymérase commence la synthèse.

Les deux amorces s’hybrident sur des brins opposés. Leurs extrémités 3′3'3′ sont orientées vers la région à amplifier, car l’ADN polymérase allonge toujours un brin dans le sens 5′→3′5' \rightarrow 3'5′→3′.

La séquence des amorces détermine donc la spécificité de la PCR. Une complémentarité insuffisante avec la cible empêche l’amplification, tandis qu’une fixation sur une autre région peut produire un amplicon non recherché.

Rôle de la polymérase thermostable

Les cycles de PCR imposent des chauffages répétés capables de dénaturer la plupart des protéines. Une polymérase thermostable conserve son activité malgré ces élévations de température. Il n’est donc pas nécessaire d’ajouter une nouvelle enzyme après chaque cycle.

Elle ne peut pas commencer seule un nouveau brin : elle ajoute les nucléotides à l’extrémité 3′-OH3'\text{-OH}3′-OH d’une amorce déjà hybridée.

Les trois étapes d’un cycle

Méthode

Déroulement d’un cycle de PCR

  1. Dénaturer l’ADN double brin par chauffage afin de séparer ses deux brins
  2. Hybrider les amorces en abaissant la température pour permettre leur appariement avec les séquences complémentaires
  3. Élonger les amorces à la température d’activité de la polymérase thermostable, qui synthétise les nouveaux brins dans le sens 5′→3′5' \rightarrow 3'5′→3′
  4. Répéter le cycle afin que les molécules nouvellement produites servent à leur tour de matrices

La température d’hybridation doit être assez basse pour permettre l’appariement, mais assez élevée pour limiter les interactions non spécifiques. Elle dépend notamment de la longueur et de la composition des amorces.

En théorie, chaque molécule cible donne deux molécules après un cycle. Les produits d’un cycle devenant les matrices du suivant, l’amplification est exponentielle.

Formule

Amplification idéale

Nn=N0×2nN_{n} = N_{0} \times 2^{n}Nn​=N0​×2n
  • NnN_{n}Nn​ : nombre de molécules cibles après nnn cycles
  • N0N_{0}N0​ : nombre initial de molécules cibles
  • nnn : nombre de cycles réalisés
  • 222 : facteur d’amplification idéal par cycle
Exemple

Calculer le nombre de copies après cinq cycles

Une PCR débute avec N0=50N_{0} = 50N0​=50 molécules cibles et comporte n=5n = 5n=5 cycles, en supposant un doublement parfait à chaque cycle.

N5=50×25N_{5} = 50 \times 2^{5}N5​=50×25N5=50×32=1 600N_{5} = 50 \times 32 = 1\,600N5​=50×32=1600

Après cinq cycles, la réaction contient théoriquement 1 6001\,6001600 molécules cibles. Ce résultat illustre que le nombre de molécules est multiplié par deux à chaque cycle dans le modèle idéal.

Cette relation suppose une efficacité parfaite. En pratique, l’amplification ralentit progressivement lorsque les réactifs deviennent limitants, que les produits s’accumulent ou que l’activité enzymatique diminue. La réaction atteint finalement un plateau, ce qui rend la quantité finale de produit peu représentative de la quantité initiale.

À retenir

La PCR repose sur la répétition ordonnée de trois étapes : dénaturation, hybridation des amorces et élongation. La spécificité vient principalement des amorces, tandis que la polymérase thermostable assure la synthèse répétée de l’ADN.

L’analyse des amplicons en fin de réaction par électrophorèse relève de la fiche consacrée à la séparation et au transfert des acides nucléiques.

Rétrotranscription et RT-PCR

La PCR classique utilise de l’ADN comme matrice. Pour étudier un ARN, il faut d’abord le convertir en ADN.

Définition

Rétrotranscription

Synthèse d’un ADN complémentaire, noté ADNc, à partir d’une matrice d’ARN grâce à une enzyme appelée transcriptase inverse.

L’ADNc obtenu peut ensuite être amplifié par PCR. L’ensemble rétrotranscription suivie de PCR est appelé RT-PCR. Les amorces utilisées pour la rétrotranscription peuvent cibler une séquence particulière, s’hybrider à de nombreux ARN ou reconnaître la queue polyadénylée des ARN messagers.

Deux organisations sont possibles :

  • dans une procédure en une étape, rétrotranscription et PCR sont réalisées successivement dans le même tube ;
  • dans une procédure en deux étapes, l’ADNc est d’abord produit séparément, puis une fraction est utilisée pour la PCR.

La première organisation limite les manipulations et le risque de contamination. La seconde permet de conserver l’ADNc et d’analyser plusieurs cibles à partir d’une même rétrotranscription.

Attention

RT-PCR et PCR quantitative ne sont pas synonymes

Dans RT-PCR, les lettres RT désignent la rétrotranscription d’un ARN en ADNc. Une RT-PCR peut être observée uniquement en fin de réaction. La mesure de fluorescence au cours des cycles définit, elle, la PCR quantitative en temps réel.

PCR quantitative en temps réel

Définition

PCR quantitative en temps réel

PCR dans laquelle l’accumulation de l’amplicon est suivie à chaque cycle grâce à un signal fluorescent, permettant d’estimer la quantité initiale d’acide nucléique.

La fluorescence peut provenir :

  • d’un colorant dont le signal augmente lorsqu’il se lie à l’ADN double brin ;
  • d’une sonde fluorescente spécifique de la séquence amplifiée.

Un colorant détecte tout ADN double brin, y compris les produits non spécifiques. Une sonde apporte une spécificité supplémentaire car son signal dépend de la reconnaissance d’une séquence interne à l’amplicon.

Cycle de quantification

Au début de la réaction, la fluorescence est trop faible pour être distinguée du bruit de fond, c’est-à-dire des variations de signal indépendantes de l’amplification détectable. Le signal augmente ensuite pendant la phase exponentielle.

Un seuil de fluorescence est fixé au-dessus du bruit de fond. Le cycle de quantification, noté CqC_qCq​, correspond au cycle auquel la fluorescence franchit ce seuil.

Plus la quantité initiale de cible est élevée, plus le seuil est franchi tôt et plus CqC_qCq​ est faible.

Formule

Amplification tenant compte de l’efficacité

NCq=N0(1+E)CqN_{C_q} = N_{0}\left(1 + E\right)^{C_q}NCq​​=N0​(1+E)Cq​
  • NCqN_{C_q}NCq​​ : quantité de produit au franchissement du seuil
  • N0N_{0}N0​ : quantité initiale de cible
  • EEE : efficacité d’amplification par cycle, comprise entre 000 et 111
  • CqC_qCq​ : cycle de quantification

Une efficacité E=1E = 1E=1 correspond à un doublement idéal à chaque cycle. La quantification exploite la phase exponentielle, avant le plateau, car la relation entre quantité initiale et signal y est encore prévisible.

Quantification absolue et relative

La quantification absolue détermine une quantité de cible à l’aide d’une gamme de référence contenant des quantités connues. Une courbe relie alors le cycle de quantification au logarithme de la quantité initiale.

La quantification relative compare l’abondance d’une cible entre plusieurs conditions. Elle nécessite une normalisation par rapport à une séquence de référence dont l’abondance est supposée stable, afin de corriger les différences de quantité d’échantillon et de rendement expérimental.

Lorsque la matrice initiale est un ARN et que la rétrotranscription est suivie d’une PCR quantitative, la méthode est appelée RT-qPCR.

À retenir

Le cycle de quantification varie en sens inverse de la quantité initiale de cible : une cible initialement abondante franchit le seuil en peu de cycles et possède donc un CqC_qCq​ faible.

Applications diagnostiques et contrôles

La PCR permet une détection qualitative lorsqu’il s’agit d’établir la présence ou l’absence d’une séquence. La PCR quantitative estime en plus sa quantité initiale. La RT-PCR et la RT-qPCR rendent accessibles les cibles constituées d’ARN et permettent aussi d’évaluer l’abondance de transcrits.

Ces méthodes peuvent contribuer au diagnostic par :

  • la détection d’un acide nucléique associé à un agent biologique ;
  • la recherche d’une séquence ou d’une variation génétique ciblée ;
  • la quantification d’une cible nucléique ;
  • l’étude de l’expression d’un gène à partir de ses ARN.

La forte sensibilité de la PCR impose plusieurs contrôles. Un témoin sans matrice recherche une contamination des réactifs. Un témoin positif vérifie que la réaction peut fonctionner. Un contrôle interne révèle une extraction insuffisante ou la présence d’un inhibiteur. Lors de l’étude d’ARN, un contrôle sans transcriptase inverse permet de rechercher une contamination par de l’ADN.

Attention

Présence d’un acide nucléique et activité biologique

La détection d’une séquence prouve sa présence dans l’échantillon, mais ne démontre pas à elle seule qu’elle provient d’une cellule ou d’un organisme encore actif. L’interprétation dépend aussi de la qualité du prélèvement et du contexte diagnostique.

Points clés
  • La PCR amplifie une région d’ADN délimitée par deux amorces orientées l’une vers l’autre
  • Chaque cycle associe dénaturation, hybridation des amorces et élongation par une polymérase thermostable
  • La rétrotranscription convertit un ARN en ADNc avant son amplification par RT-PCR
  • La PCR quantitative mesure la fluorescence à chaque cycle et exploite le cycle de quantification CqC_qCq​
  • Un CqC_qCq​ faible traduit une quantité initiale de cible élevée
  • Les contrôles permettent de détecter contamination, inhibition et défaut d’extraction

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À réviser dans la foulée, sur Méthodes.

  • Fiche 02Électrophorèse des acides nucléiques et techniques de transfertMéthodes
  • Fiche 03Séquençage : méthode de Sanger et séquençage haut débitMéthodes
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