B3 · Méthodes
Édition génomique et CRISPR-Cas9
Décrire le principe du ciblage d'une séquence par un ARN guide et la coupure double brin par la nucléase associée. Relier les voies de réparation mobilisées aux modifications obtenues et présenter les enjeux thérapeutiques et éthiques.
Biologie moléculaire et génome8 min de lecture17 QCM corrigés
Principe général de l'édition génomique
L'édition génomique repose sur deux opérations successives :
- reconnaître une séquence déterminée dans l'ADN ;
- provoquer une lésion à cet endroit, puis exploiter les mécanismes cellulaires de réparation pour obtenir la modification recherchée.
Le système CRISPR-Cas9 sépare ces deux fonctions. Un ARN guide détermine la cible par complémentarité des bases, tandis que la protéine Cas9 réalise la coupure. Il suffit donc de modifier la séquence de l'ARN guide pour rediriger le système vers une autre région du génome, sans avoir à reconstruire une nouvelle nucléase.
CRISPR correspond à des courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacées. Ce système dérive d'un mécanisme de défense des bactéries contre les acides nucléiques étrangers. Son utilisation expérimentale repose sur une version simplifiée et programmable de ce mécanisme naturel.
Les acteurs du ciblage
L'ARN guide
Dans le système naturel, la reconnaissance implique deux ARN : un ARN contenant la séquence de ciblage et un ARN assurant l'interaction avec Cas9. En édition génomique, ils sont généralement réunis en un ARN guide unique.
La partie variable de cet ARN contient habituellement une vingtaine de nucléotides complémentaires d'un des brins de l'ADN cible. Cette région détermine donc la spécificité du ciblage selon les règles d'appariement des bases : A avec U dans l'ARN, et G avec C.
La nucléase Cas9
Cas9 est une endonucléase, car elle coupe l'ADN à l'intérieur d'une molécule plutôt qu'à son extrémité. Une fois liée à l'ARN guide, elle forme un complexe capable d'explorer l'ADN à la recherche d'une cible compatible.
Cas9 possède deux domaines catalytiques principaux. Chacun coupe l'un des deux brins de l'ADN, ce qui produit une cassure double brin.
Le motif PAM
PAM signifie motif adjacent au proto-espace. Le proto-espace est la séquence d'ADN complémentaire de la partie variable de l'ARN guide. La nature exacte du motif PAM dépend de la nucléase utilisée.
La reconnaissance commence par la recherche d'un motif PAM. Cas9 ouvre ensuite localement la double hélice et permet à l'ARN guide de tester la complémentarité avec la séquence voisine. Si l'appariement est suffisant, Cas9 adopte une conformation active et coupe l'ADN.
De la reconnaissance à la cassure double brin
Le mécanisme peut être décomposé en étapes ordonnées.
La coupure ne constitue donc pas, à elle seule, la modification finale. Cas9 crée une lésion ciblée, mais c'est la voie de réparation de l'ADN qui détermine la nature du résultat.
Réparation de la cassure et modification obtenue
Jonction d'extrémités non homologues
Cette voie est rapide et fonctionne dans de nombreuses phases du cycle cellulaire. Cependant, les extrémités peuvent être remaniées avant leur réunion. La réparation produit alors de petites insertions ou délétions, regroupées sous le terme d'indels.
Si un indel atteint une séquence codante, il peut décaler le cadre de lecture ou introduire un signal d'arrêt prématuré. La protéine correspondante peut alors perdre sa fonction. Le résultat précis reste toutefois en partie aléatoire, car plusieurs réparations différentes sont possibles après une même coupure.
Réparation dirigée par homologie
Pour orienter cette réparation, une matrice donneuse peut être apportée avec le système CRISPR-Cas9. Elle contient la modification souhaitée entourée de séquences homologues aux régions situées de part et d'autre de la cassure. La cellule copie alors l'information portée par cette matrice.
Cette voie permet une substitution précise de nucléotides, une insertion définie ou le remplacement d'une séquence. Elle est néanmoins souvent moins efficace que la jonction d'extrémités non homologues et dépend davantage du cycle cellulaire, notamment des phases au cours desquelles une matrice homologue est disponible.
Limites techniques et contrôle du résultat
Une modification hors cible est une altération produite dans une région du génome différente de la cible recherchée. Elle peut survenir lorsqu'une séquence ressemble suffisamment à la cible pour permettre la fixation du complexe. Le choix de l'ARN guide doit donc rechercher à la fois une forte complémentarité avec la cible et une faible similitude avec les autres régions du génome.
Une coupure au site attendu peut également entraîner des remaniements plus importants que les petits indels recherchés. Enfin, toutes les cellules traitées ne reçoivent pas nécessairement le système ou ne réparent pas l'ADN de la même manière.
L'efficacité et la sécurité dépendent également de l'acheminement de Cas9 et de l'ARN guide jusqu'aux cellules visées, de la durée de leur présence et d'une éventuelle réponse immunitaire. Les vecteurs et les principes de l'ADN recombinant relèvent de la fiche consacrée au clonage, tandis que la vérification de la modification repose sur les méthodes de PCR et de séquençage étudiées dans les fiches voisines.
Enjeux thérapeutiques
L'édition peut être réalisée hors de l'organisme, sur des cellules prélevées puis contrôlées avant leur réintroduction, ou directement dans l'organisme. La première stratégie facilite la sélection et l'analyse des cellules modifiées. La seconde peut atteindre des tissus non prélevables, mais rend plus difficile la maîtrise de la distribution du système.
Une intervention thérapeutique doit mettre en balance :
- le bénéfice attendu de la modification ;
- l'efficacité d'accès aux cellules pertinentes ;
- la fréquence des modifications hors cible ;
- le risque de remaniements imprévus au site ciblé ;
- la persistance de l'effet et ses conséquences à long terme.
La modification du génome étant potentiellement durable, une erreur peut elle aussi être durable. Le contrôle moléculaire du résultat et le suivi prolongé sont donc indispensables.
Enjeux éthiques
L'édition des cellules somatiques peut être discutée dans un objectif thérapeutique avec le consentement de la personne concernée. L'édition germinale soulève des difficultés supplémentaires : effets transmis à la descendance, incertitudes à long terme et impossibilité pour les générations futures de consentir.
D'autres enjeux concernent la frontière entre traitement et augmentation de capacités, l'équité d'accès aux techniques, le risque de sélection de caractères humains et la responsabilité collective vis-à-vis des modifications héréditaires. Ces enjeux justifient une évaluation scientifique, médicale, juridique et sociale rigoureuse.
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