B5 · Techniques histologiques
Colorations usuelles et lecture d'une coupe histologique
Présenter les colorations topographiques et spéciales et ce que chacune met en évidence. Donner une méthode de lecture d'une coupe : repérage du grossissement, identification du tissu, orientation et reconnaissance des structures.
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Principe général d'une coloration histologique
Après fixation, inclusion et coupe, étapes étudiées dans la fiche précédente, la plupart des tissus restent presque incolores. Une coloration augmente le contraste en faisant réagir certains constituants tissulaires avec des colorants ou des réactifs chimiques.
Une coloration topographique permet donc de s'orienter et d'identifier l'architecture du tissu. Une coloration spéciale répond à une question plus ciblée. Ces deux approches sont complémentaires : la première localise les structures, la seconde aide à caractériser leur composition.
Avant coloration, les coupes incluses en paraffine doivent être déparaffinées puis réhydratées. Après coloration, elles sont habituellement déshydratées, éclaircies et montées entre lame et lamelle. Les mécanismes techniques de préparation appartiennent à la fiche précédente.
Coloration HES
La coloration hématoxyline-éosine-safran, ou HES, est une coloration topographique de routine. Elle associe trois colorants dont les affinités différentes rendent visibles les principaux compartiments de la coupe.
Hématoxyline et basophilie
L'hématoxyline, utilisée sous forme de laque colorante, colore en bleu à violet les structures riches en groupements acides. Elle révèle principalement les noyaux en raison de leur richesse en acides nucléiques. Les régions cytoplasmiques riches en ARN peuvent également apparaître basophiles.
La basophilie ne signifie donc pas que la structure observée est elle-même basique. Elle signifie qu'elle fixe un colorant basique parce qu'elle contient des groupements acides.
Éosine et acidophilie
L'éosine est un colorant acide qui se fixe sur de nombreuses protéines chargées positivement. Elle colore en rose à rouge une grande partie des cytoplasmes ainsi que plusieurs constituants extracellulaires.
Les termes éosinophile et acidophile sont souvent employés pour décrire une structure rose ou rouge après coloration à l'éosine.
Safran et tissu conjonctif
Le safran colore préférentiellement le collagène en jaune à orangé. Il améliore ainsi la distinction entre les compartiments cellulaires, principalement colorés par l'éosine, et certaines composantes fibreuses de la matrice extracellulaire.
Trichromes
Un trichrome associe plusieurs colorants afin de renforcer la séparation entre noyaux, cytoplasmes et fibres conjonctives. Il s'agit d'une coloration topographique particulièrement utile lorsque l'analyse porte sur la proportion et la répartition du tissu conjonctif.
Dans un trichrome usuel :
- les noyaux apparaissent sombres ;
- les cytoplasmes et les fibres musculaires prennent une teinte rouge ;
- le collagène prend une teinte verte ou bleue selon la variante technique.
La couleur exacte dépend des réactifs employés. Il faut donc connaître le protocole de la lame avant d'attribuer une signification à une teinte.
Réaction PAS
La réaction PAS, pour acide périodique-Schiff, est une coloration histochimique spéciale. L'acide périodique oxyde certains groupements glucidiques et forme des fonctions aldéhydes. Celles-ci réagissent ensuite avec le réactif de Schiff pour produire une coloration rouge pourpre, dite magenta.
La réaction PAS met notamment en évidence :
- le glycogène ;
- les glycoprotéines et certaines mucines neutres ;
- les membranes basales ;
- d'autres structures riches en glucides complexes.
La digestion préalable du glycogène par une amylase permet de contrôler sa contribution au signal. Une coloration qui disparaît après cette digestion correspond à un matériel sensible à l'enzyme.
Méthode de lecture d'une coupe histologique
L'interprétation doit progresser du général vers le particulier. Commencer directement au fort grossissement fait perdre l'organisation d'ensemble et augmente le risque de confondre une structure avec un détail isolé.
Repérer le grossissement
Le grossissement total d'un microscope optique correspond au produit du grossissement de l'objectif par celui de l'oculaire.
Un faible grossissement offre un champ large et montre l'architecture générale. Un fort grossissement réduit le champ mais permet d'étudier les cellules et les détails intracellulaires. Le grossissement ne doit pas être confondu avec la résolution, qui désigne la capacité à distinguer deux points proches.
Identifier le tissu
L'identification repose sur un ensemble cohérent de critères :
- organisation des cellules en couches, cordons, amas ou réseaux ;
- abondance relative des cellules et de la matrice extracellulaire ;
- présence de fibres, de cavités, de conduits ou de vaisseaux ;
- forme, taille et disposition des noyaux ;
- relations entre les différents compartiments.
La classification détaillée des quatre grands types de tissus et leur origine embryonnaire relèvent de la fiche suivante.
Orienter la coupe
L'orientation consiste à reconnaître les pôles et les limites de la structure observée. Il faut rechercher une surface libre, une lumière, une capsule, une interface avec un autre tissu ou un axe vasculaire. Ces repères permettent de distinguer une périphérie d'un centre et un pôle superficiel d'un pôle profond.
Le plan de coupe modifie l'apparence d'une même structure : une structure tubulaire peut sembler circulaire, ovalaire ou allongée selon que la coupe est transversale, oblique ou longitudinale. La forme visible en deux dimensions doit donc être interprétée comme la section d'un objet tridimensionnel.
Limites de l'interprétation
Une coupe histologique est une représentation bidimensionnelle, colorée et préparée artificiellement d'un tissu tridimensionnel. Des rétractions, plis, déchirures, précipités de colorant ou variations d'épaisseur peuvent apparaître au cours de la préparation.
Un artefact est une modification produite par la préparation et absente du tissu vivant. Il se reconnaît notamment par son absence de cohérence avec l'organisation générale, ses limites anormalement brutales ou sa répétition indépendante des structures anatomiques.
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