B5 · Techniques histologiques

Préparation des tissus : fixation, inclusion et coupe

Décrire les étapes menant d'un prélèvement à une lame observable : fixation, déshydratation, inclusion, coupe. Expliquer l'effet de chaque étape sur la conservation des structures et les artefacts qu'elle peut créer.

Histologie7 min de lecture17 QCM corrigés

Finalité de la préparation histologique

L’observation microscopique d’un tissu exige une lame mince, stable et représentative du prélèvement initial. Or un tissu vivant se dégrade rapidement après son prélèvement et reste trop mou et trop épais pour être traversé correctement par la lumière. Sa préparation vise donc à arrêter les altérations biologiques, à lui donner une consistance suffisante, puis à obtenir des sections régulières.

La chaîne conventionnelle repose sur quatre étapes principales :

la fixation, qui stabilise les constituants tissulaires ;
la déshydratation, qui retire progressivement l’eau ;
l’inclusion, qui imprègne puis enrobe le tissu dans un milieu solide ;
la coupe, qui produit des sections suffisamment minces.

Chaque opération conserve certaines caractéristiques mais peut aussi modifier le tissu. L’image finale n’est donc jamais une reproduction parfaitement intacte du tissu vivant.

Du prélèvement à la fixation

Qualité du prélèvement

Le prélèvement est le fragment de tissu retiré en vue de son étude. Sa qualité conditionne toutes les étapes ultérieures. Il doit être manipulé sans compression, étirement, écrasement ni dessiccation.

Les fragments trop épais ralentissent la pénétration du fixateur. Leur périphérie est alors stabilisée avant leur centre, qui peut commencer à se dégrader. La taille du prélèvement doit donc permettre une diffusion homogène du produit de fixation.

L’orientation du prélèvement doit être anticipée dès cette étape : le plan selon lequel le tissu sera inclus détermine le plan de coupe et donc l’aspect des structures observées. Une orientation inadaptée peut donner une image réelle mais peu informative.

Autolyse et putréfaction

Après le prélèvement, les membranes perdent progressivement leur intégrité et les enzymes intracellulaires altèrent les constituants du tissu. Une contamination microbienne peut également provoquer une putréfaction, c’est-à-dire une dégradation liée à la prolifération de micro-organismes. La fixation doit donc commencer rapidement.

Fixation du tissu

Les fixateurs chimiques diffusent dans le prélèvement et modifient les molécules biologiques. Les fixateurs aldéhydiques créent notamment des liaisons entre certaines protéines. Ce pontage moléculaire immobilise les macromolécules, renforce la cohésion du tissu et inactive de nombreuses enzymes responsables de l’autolyse.

Une fixation correcte dépend de plusieurs paramètres :

le délai entre le prélèvement et l’immersion dans le fixateur ;
la concentration et la nature du fixateur ;
le rapport entre le volume de fixateur et celui du tissu ;
la durée de fixation ;
la température ;
l’épaisseur du prélèvement.

Une fixation insuffisante laisse persister l’autolyse, rend le tissu fragile et favorise les déformations pendant la coupe. À l’inverse, une fixation excessive peut durcir le tissu, masquer certains constituants moléculaires et diminuer leur accessibilité lors des marquages ultérieurs.

Artefacts de fixation

La fixation peut provoquer :

une rétraction des cellules ou de la matrice extracellulaire ;
des espaces artificiels entre des structures auparavant jointives ;
une modification de la forme cellulaire ;
une précipitation ou une redistribution de constituants solubles ;
une coloration de fond ou des dépôts liés au fixateur ;
un durcissement hétérogène lorsque la pénétration est incomplète.

Déshydratation et remplacement du milieu aqueux

Les tissus biologiques contiennent beaucoup d’eau, tandis que le milieu d’inclusion conventionnel à base de paraffine n’est pas miscible avec l’eau. Celle-ci doit donc être retirée avant l’imprégnation.

La progression graduelle limite les changements brutaux de volume et de consistance. Une déshydratation trop rapide ou trop prolongée entraîne une rétraction, un durcissement et une fragilisation du tissu. Elle peut aussi extraire certains constituants solubles, notamment des lipides, qui laisseront à leur place des espaces optiquement vides.

Après la déshydratation, un agent intermédiaire remplace le déshydratant. Cette étape, parfois appelée clarification, utilise un liquide miscible à la fois avec le produit de déshydratation et avec la paraffine. Elle rend possible le passage entre deux milieux qui ne pourraient pas se mélanger directement.

Une clarification incomplète empêche l’imprégnation homogène. Une clarification excessive peut accroître la dureté et la rétraction du prélèvement.

Imprégnation et inclusion

Le tissu est placé dans de la paraffine liquéfiée, qui pénètre dans les espaces libérés par l’eau et les solvants. Après refroidissement, la paraffine devient solide et soutient mécaniquement les structures pendant la coupe.

L’inclusion ne consiste donc pas seulement à entourer le tissu : le milieu doit également avoir pénétré dans son épaisseur. Le prélèvement est orienté avant la solidification du bloc afin que la surface rencontrée par la lame de coupe corresponde au plan d’étude recherché.

Les principaux défauts de cette étape sont :

une imprégnation incomplète, responsable de zones molles ou déchirées ;
des bulles ou des cavités dans le bloc ;
une température excessive, susceptible d’altérer les constituants ;
une mauvaise orientation, qui modifie la section des structures ;
une solidification irrégulière, qui nuit à l’homogénéité de la coupe.

Coupe et dépôt sur lame

Le bloc est d’abord dégrossi pour atteindre le tissu. Le microtome produit ensuite des coupes minces, souvent réunies en ruban. Ces coupes sont étalées sur un bain tiède afin de réduire les plis, puis recueillies sur une lame de verre où elles adhèrent pendant le séchage.

La coupe doit être assez mince pour permettre la transmission de la lumière et limiter la superposition des structures. Si elle est trop épaisse, les contours se chevauchent et l’observation devient confuse. Si elle est trop mince, la section peut se déchirer ou ne pas contenir l’ensemble des éléments recherchés.

Artefacts de coupe

Une lame émoussée, un bloc trop dur ou trop mou, une avance irrégulière du microtome ou une mauvaise adhérence à la lame peuvent produire :

des stries parallèles ;
des déchirures ;
des compressions ;
des plis ;
des variations d’épaisseur ;
des fragments manquants ;
des déplacements de particules d’une zone à une autre ;
un décollement de la coupe lors des traitements ultérieurs.

L’étalement sur un bain trop chaud peut distendre la coupe et accentuer la perte de certains constituants. À l’inverse, un étalement insuffisant laisse persister des plis dans lesquels plusieurs épaisseurs de tissu se superposent.

De la lame technique à l’interprétation

Une coupe non colorée présente généralement un contraste faible, car de nombreux constituants biologiques absorbent peu la lumière visible. Les colorations usuelles et la lecture systématique des coupes relèvent des fiches suivantes du sous-bloc.

Avant toute interprétation, il faut distinguer trois niveaux :

l’organisation biologique du tissu ;
les modifications prévisibles dues à la préparation ;
les défauts accidentels responsables d’artefacts.

Un artefact peut imiter un espace, une rupture, une limite ou une variation de densité. Son caractère répétitif, son orientation, sa présence en bordure de coupe ou sa concordance avec une contrainte technique peuvent orienter vers son origine.

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