B3 · Acides nucléiques
Dénaturation, hybridation et propriétés physicochimiques de l'ADN
Décrire la dénaturation thermique de l'ADN, la température de fusion et sa dépendance à la composition en bases. Expliquer la renaturation et l'hybridation moléculaire comme fondement des techniques d'analyse.
Biologie moléculaire et génome6 min de lecture15 QCM corrigés
Propriétés physicochimiques utiles de l'ADN
La structure détaillée de la double hélice et les règles d'appariement sont étudiées dans la fiche précédente. Ici, il suffit de retenir que deux brins complémentaires s'associent de manière antiparallèle grâce aux liaisons hydrogène entre bases et aux interactions d'empilement entre bases voisines.
Absorption des ultraviolets
Les bases azotées possèdent des systèmes électroniques capables d'absorber les rayonnements ultraviolets. Les acides nucléiques présentent ainsi une forte absorption autour de . Cette propriété permet de détecter et de quantifier globalement l'ADN en solution.
Dans l'ADN bicaténaire, c'est-à-dire formé de deux brins, l'empilement régulier des bases diminue leur absorption. Lorsque les deux brins se séparent, les bases deviennent davantage exposées au solvant et l'absorbance à augmente.
L'effet hyperchrome fournit donc un moyen physique de suivre la transition entre ADN bicaténaire et ADN monocaténaire.
Dénaturation de l'ADN
La dénaturation peut être provoquée par une élévation de température, par des valeurs extrêmes de pH ou par des agents chimiques qui perturbent les liaisons hydrogène et l'empilement des bases. La dénaturation thermique correspond à la séparation des brins sous l'effet de la chaleur.
L'agitation thermique déstabilise progressivement les interactions entre bases. La séparation ne survient pas simultanément sur toute la molécule. Elle commence dans les régions les moins stables, puis s'étend de manière coopérative aux régions voisines. La courbe représentant l'absorbance à en fonction de la température a donc généralement une allure sigmoïde.
Température de fusion
La température de fusion correspond au milieu de la transition observée sur la courbe de dénaturation. Elle n'est pas une constante universelle de l'ADN, car elle dépend à la fois de la séquence étudiée et du milieu.
Facteurs déterminant la stabilité du duplex
La composition en bases est un déterminant majeur. Une paire guanine-cytosine comporte trois liaisons hydrogène, contre deux pour une paire adénine-thymine. Les interactions d'empilement participent également fortement à la stabilité. À longueur et conditions identiques, une proportion élevée de paires guanine-cytosine augmente donc généralement la stabilité du duplex et sa .
La température de fusion dépend aussi des facteurs suivants :
- Longueur du duplex : un duplex suffisamment long possède davantage d’interactions stabilisatrices.
- Complémentarité : des bases non appariées ou mal appariées déstabilisent localement la double hélice.
- Force ionique : les cations écrantent les charges négatives des groupements phosphate, ce qui réduit la répulsion entre les deux brins et stabilise le duplex.
- pH : des valeurs extrêmes modifient l'état d'ionisation des bases et perturbent leur appariement.
- Agents dénaturants : certaines molécules diminuent la stabilité des interactions entre bases.
Renaturation de l'ADN
La renaturation est possible si la dénaturation n'a pas dégradé les brins. Elle exige une température assez basse pour permettre l'appariement, mais pas trop basse, afin d'éviter la stabilisation durable d'associations incorrectes.
Le mécanisme comporte deux étapes. D'abord, deux régions complémentaires se rencontrent et forment un petit noyau apparié : c'est la nucléation. Ensuite, l'appariement s'étend rapidement le long des brins selon un mécanisme de fermeture progressive.
La vitesse de renaturation dépend de la probabilité de rencontre entre brins complémentaires. Elle augmente avec leur concentration et avec la durée d'incubation. Elle dépend aussi de la complexité des séquences : plus il existe de séquences différentes dans le mélange, plus la recherche du partenaire exact est lente.
Hybridation moléculaire
L'hybridation repose sur le même principe physicochimique que la renaturation. Le terme est toutefois plus général : les deux brins associés peuvent provenir de molécules distinctes et former un duplex ADN-ADN ou ADN-ARN.
La séquence cible est la région recherchée dans l'échantillon. Si elle est suffisamment complémentaire de la sonde, un duplex se forme. Le marqueur porté par la sonde rend alors cette association détectable. La spécificité ne vient donc pas directement du marqueur, mais de la complémentarité entre la sonde et la cible.
Stringence de l'hybridation
Une forte stringence favorise le maintien des duplex parfaitement ou presque parfaitement complémentaires. Elle est obtenue par des conditions déstabilisantes, notamment une température plus proche de la , une force ionique plus faible ou la présence d'agents dénaturants.
Une faible stringence autorise le maintien de duplex comportant davantage de mésappariements. Le choix de la stringence détermine donc le compromis entre détection de séquences proches et discrimination de différences de séquence.
Ce principe fonde de nombreuses techniques d'analyse des acides nucléiques. Leurs procédures particulières, notamment les techniques de transfert, l'amplification et le séquençage, sont traitées dans les fiches méthodologiques correspondantes.
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