B4 · Méthodes d'étude
Immunomarquages : immunohistochimie et immunofluorescence
Décrire le principe de la détection d'un antigène par un anticorps spécifique et l'intérêt du marquage indirect. Présenter les contrôles nécessaires et l'interprétation d'un marquage sur coupe ou sur cellules.
Biologie cellulaire6 min de lecture15 QCM corrigés
Principe de l’immunomarquage
L’immunomarquage permet de détecter et de localiser une molécule dans des cellules isolées ou dans une coupe de tissu. Il repose sur la reconnaissance sélective d’une structure moléculaire par un anticorps.
La liaison entre l’anticorps et son épitope repose sur des interactions non covalentes. Elle dépend notamment de leur complémentarité structurale et des conditions physicochimiques du milieu. La spécificité désigne la capacité de l’anticorps à reconnaître préférentiellement sa cible, tandis que son affinité traduit la force de la liaison avec un épitope donné.
L’anticorps fixé n’est pas nécessairement visible. Il doit donc être associé directement ou indirectement à un marqueur détectable. Ce marqueur transforme la présence de l’antigène en un signal observable.
Marquage direct et marquage indirect
Marquage direct
Dans un marquage direct, l’anticorps primaire porte lui-même le marqueur. La procédure comporte donc une seule reconnaissance immunologique : l’anticorps marqué se fixe directement sur l’antigène.
Cette méthode est rapide et limite le nombre de réactifs. Cependant, chaque antigène ne peut fixer qu’un nombre limité d’anticorps primaires, ce qui restreint l’intensité du signal.
Marquage indirect
Dans un marquage indirect, l’anticorps primaire n’est pas marqué. Il est ensuite reconnu par un anticorps secondaire portant le marqueur.
Plusieurs anticorps secondaires peuvent se fixer sur un même anticorps primaire. Le nombre de marqueurs associés à chaque antigène augmente donc, ce qui produit une amplification du signal. Un même anticorps secondaire marqué peut aussi servir à révéler différents anticorps primaires issus de la même espèce.
Immunohistochimie et immunofluorescence
Immunohistochimie enzymatique
L’immunohistochimie recherche un antigène dans une coupe tissulaire en conservant autant que possible son organisation morphologique. Dans sa forme enzymatique, l’anticorps révélateur est associé à une enzyme. Après ajout d’un substrat, l’enzyme produit localement un dépôt coloré insoluble, visible en microscopie optique.
La localisation du dépôt indique la position de l’antigène. Une contre-coloration peut rendre visibles les structures générales du tissu afin de replacer le signal dans son contexte morphologique.
Immunofluorescence
En immunofluorescence, le marqueur est un fluorochrome. Après excitation lumineuse appropriée, les zones contenant l’antigène émettent un signal fluorescent. Plusieurs fluorochromes aux spectres distincts peuvent être associés à différents anticorps afin d’étudier plusieurs cibles dans le même échantillon.
Les principes physiques de la fluorescence et de la microscopie confocale relèvent des fiches consacrées à la microscopie optique.
Préparation de l’échantillon
La qualité du marquage dépend autant de la préparation de l’échantillon que de l’anticorps utilisé. La fixation conserve l’organisation cellulaire, mais elle peut modifier ou masquer certains épitopes. Une fixation insuffisante altère la morphologie, tandis qu’une fixation excessive peut réduire l’accessibilité de l’antigène.
Dans une coupe incluse, l’enrobage doit être retiré avant l’incubation. Une étape de démasquage antigénique peut ensuite restaurer l’accessibilité de certains épitopes masqués par la fixation.
Pour rechercher un antigène intracellulaire, la membrane plasmique doit être rendue perméable. La perméabilisation crée des passages permettant aux anticorps d’atteindre le cytoplasme, les organites ou le noyau. Elle n’est pas nécessaire lorsque la cible est exclusivement exposée à la surface d’une cellule intacte.
Enfin, une étape de saturation occupe les sites susceptibles de fixer les anticorps de manière non spécifique. Elle diminue ainsi le bruit de fond.
Contrôles indispensables
Un signal observé ne prouve pas, à lui seul, que l’antigène est présent. Il faut distinguer le signal spécifique du bruit de fond, de l’autofluorescence et des fixations non spécifiques.
Contrôle positif
Le contrôle positif est un échantillon dont l’expression de l’antigène est connue. Il vérifie que l’anticorps, la préparation, la révélation et les conditions d’observation permettent effectivement de détecter la cible.
L’absence de signal dans le contrôle positif invalide l’interprétation d’un résultat négatif dans l’échantillon étudié.
Contrôles négatifs
Le contrôle sans anticorps primaire est soumis à toute la procédure sauf à l’incubation avec cet anticorps. Un signal persistant indique une fixation non spécifique de l’anticorps secondaire, une activité enzymatique propre à l’échantillon ou une fluorescence indépendante de la cible.
Un anticorps témoin de même classe que l’anticorps primaire, mais dépourvu de spécificité pour l’antigène recherché, peut évaluer les interactions non spécifiques liées aux immunoglobulines.
Lorsque plusieurs anticorps et plusieurs fluorochromes sont employés, des contrôles séparés vérifient également l’absence de reconnaissance croisée entre anticorps secondaires et l’absence de chevauchement gênant entre les signaux.
Interpréter un marquage
L’interprétation associe toujours trois niveaux : présence du signal, localisation et comparaison avec les contrôles.
Sur une coupe, il faut déterminer quelles cellules ou quelles régions tissulaires sont marquées, puis préciser la localisation subcellulaire du signal : membrane, cytoplasme, noyau ou compartiment ponctiforme. Sur des cellules isolées, il faut également examiner l’homogénéité du marquage dans la population et sa distribution à l’intérieur de chaque cellule.
L’intensité observée dépend de la quantité d’antigène, mais aussi de son accessibilité, de l’affinité de l’anticorps, de la durée d’incubation, de l’amplification et des paramètres d’acquisition. Un immunomarquage fournit donc avant tout une information de localisation et une appréciation comparative dans des conditions strictement identiques.
Une superposition spatiale de deux signaux suggère une colocalisation, mais elle ne démontre ni une interaction moléculaire directe ni une liaison physique entre les deux cibles.
Entre ton email pour débloquer le reste de cette fiche
Il reste 3 sections à lire — plus les QCM corrigés, l'examen blanc et le suivi. 72 h d'essai gratuit, sans carte bancaire.