B4 · Méthodes d'étude
Microscopie optique : principes, contraste et fluorescence
Décrire le trajet de la lumière dans un microscope, le grandissement, la résolution et ses limites. Comparer fond clair, contraste de phase, fluorescence et microscopie confocale et leurs domaines d'emploi.
Biologie cellulaire7 min de lecture17 QCM corrigés
Formation de l'image en microscopie optique
La microscopie optique utilise la lumière visible pour former une image agrandie d'un objet trop petit pour être distingué à l'œil nu. La qualité de cette image dépend du trajet lumineux, des lentilles, de la préparation observée et du mode de détection.
Trajet de la lumière
Dans un microscope optique en transmission, la lumière suit successivement plusieurs éléments :
- une source lumineuse produit le rayonnement ;
- un système d'éclairage et un diaphragme règlent la quantité et l'ouverture du faisceau ;
- le condenseur concentre la lumière sur la préparation ;
- la lumière traverse la préparation, où elle est absorbée, déviée ou retardée ;
- l'objectif recueille la lumière issue de la préparation et forme une image réelle agrandie ;
- l'oculaire agrandit cette image pour l'observation visuelle, ou un capteur la convertit en image numérique.
L'objectif transforme chaque point de l'objet en une petite tache lumineuse en raison de la diffraction. Une image microscopique n'est donc jamais une reproduction géométriquement parfaite de l'objet.
Grandissement
Dans un microscope muni d'un oculaire, le grandissement total résulte de la multiplication des grandissements de l'objectif et de l'oculaire.
Augmenter le grandissement rend l'image plus grande, mais ne fait pas nécessairement apparaître davantage de détails. Au-delà de la capacité de résolution de l'objectif, on obtient un grandissement vide : l'image est agrandie sans apport d'information.
Résolution et limites physiques
La résolution est décrite par la plus petite distance séparant deux points encore discernables. Plus est faible, meilleure est la résolution.
La lumière subit une diffraction lorsqu'elle traverse l'objectif. L'image d'un point devient ainsi une tache de diffraction. Deux points ne sont distinguables que si leurs taches se recouvrent suffisamment peu.
Ouverture numérique
Une ouverture numérique élevée permet de recueillir des rayons plus inclinés et donc davantage d'information spatiale. Elle améliore à la fois la luminosité et la résolution.
La résolution s'améliore donc lorsque la longueur d'onde diminue ou lorsque l'ouverture numérique augmente. Elle reste toutefois limitée par la diffraction. La résolution suivant l'axe optique, dite résolution axiale, est moins bonne que la résolution latérale : une structure apparaît étalée en profondeur.
La qualité observable dépend aussi :
- du contraste propre de la préparation ;
- de la mise au point ;
- de l'ouverture du condenseur ;
- des aberrations des lentilles ;
- du rapport entre le signal utile et le bruit ;
- de l'échantillonnage par le capteur numérique.
Contraste et observation en fond clair
Microscopie en fond clair
En fond clair, la préparation est éclairée par transmission et observée sur un arrière-plan lumineux. Les régions qui absorbent ou diffusent davantage la lumière apparaissent plus sombres.
Ce mode convient surtout aux préparations présentant un contraste naturel suffisant ou ayant été fixées et colorées. Il fournit une vue générale de l'organisation et de la morphologie, mais il distingue difficilement les cellules vivantes transparentes et non colorées.
Les colorations augmentent le contraste en absorbant sélectivement certaines longueurs d'onde. Elles nécessitent fréquemment une préparation préalable susceptible d'altérer l'organisation vivante.
Contraste de phase
La plupart des constituants cellulaires transparents absorbent peu la lumière. Ils modifient néanmoins sa vitesse de propagation en fonction de leur indice de réfraction et de leur épaisseur. Ces variations produisent des décalages de phase, invisibles directement pour l'œil.
Un diaphragme annulaire du condenseur produit un cône d'éclairage. Dans l'objectif, une lame de phase modifie différemment la lumière directe et la lumière diffractée par la préparation. Leur interférence convertit alors les décalages de phase en zones claires et sombres.
Cette méthode permet d'observer des cellules vivantes non colorées et de suivre leur morphologie ou leurs mouvements. Elle ne confère toutefois pas de spécificité moléculaire. Elle peut aussi produire des halos lumineux autour des contours, qui ne correspondent pas à des structures réelles.
Microscopie de fluorescence
Principe de la fluorescence
La différence entre les longueurs d'onde d'excitation et d'émission permet de les séparer optiquement. En épifluorescence, l'objectif sert à la fois à éclairer la préparation et à recueillir la lumière émise.
Le trajet comporte trois éléments sélectifs :
- un filtre d'excitation sélectionne la lumière envoyée vers le fluorochrome ;
- un miroir dichroïque réfléchit cette lumière vers la préparation, mais transmet la lumière d'émission ;
- un filtre d'émission élimine la lumière d'excitation résiduelle avant l'observation.
La fluorescence révèle uniquement les structures porteuses du fluorochrome. Elle offre ainsi une forte spécificité et permet de distinguer simultanément plusieurs signaux si leurs spectres sont séparables.
L'immunofluorescence, fondée sur la reconnaissance par des anticorps, appartient à la fiche consacrée aux immunomarquages.
Limites de la fluorescence
L'excitation prolongée peut détruire progressivement les fluorochromes : c'est le photoblanchiment. Elle peut également altérer les cellules vivantes par phototoxicité. Enfin, certaines molécules de la préparation émettent spontanément une autofluorescence, qui augmente le bruit de fond.
Dans une préparation épaisse, la fluorescence provenant des plans situés hors de la mise au point se superpose au signal du plan observé. L'image perd alors en contraste, même si l'objectif possède une bonne résolution.
Microscopie confocale
Un faisceau lumineux focalisé balaie la préparation point par point. La lumière émise repasse par l'objectif puis atteint un petit diaphragme placé dans un plan conjugué du plan focal. La lumière issue du foyer traverse ce diaphragme, tandis qu'une grande partie de la fluorescence hors foyer est arrêtée.
Le microscope confocal réalise ainsi une coupe optique, c'est-à-dire l'image d'une tranche virtuelle de la préparation sans coupe matérielle. L'acquisition de plans successifs à différentes profondeurs permet une reconstruction volumique.
Le principal gain est l'amélioration du contraste et de la résolution axiale. La résolution latérale n'est améliorée que modérément, car la diffraction demeure. Le balayage peut ralentir l'acquisition et accroître le photoblanchiment si l'exposition est importante.
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