B4 · Méthodes d'étude
Fractionnement cellulaire et ultracentrifugation
Décrire la lyse cellulaire et la séparation des organites par centrifugation différentielle et sur gradient de densité. Expliquer le contrôle de pureté d'une fraction par ses marqueurs enzymatiques.
Biologie cellulaire7 min de lecture17 QCM corrigés
Principe du fractionnement cellulaire
Le fractionnement repose sur deux opérations successives :
- désorganiser les cellules sans détruire les structures que l'on souhaite isoler ;
- séparer les constituants selon leurs propriétés physiques, principalement leur taille, leur forme et leur densité.
Une fraction n'est généralement pas constituée d'un seul type d'organite. Elle est seulement enrichie en une structure donnée. Sa composition doit donc être contrôlée après la séparation.
Les méthodes microscopiques et les immunomarquages peuvent compléter ce contrôle, mais leurs principes sont traités dans les fiches voisines du sous-bloc.
De la cellule à l'homogénat
Préparation du matériel biologique
Les cellules isolées ou les tissus sont placés dans un milieu qui préserve les organites. Ce milieu doit généralement être :
- tamponné, afin de maintenir un pH stable ;
- isotonique, afin d'éviter le gonflement ou la rétraction osmotique des organites ;
- froid, afin de ralentir les réactions enzymatiques et la dégradation ;
- compatible avec l'ajout éventuel d'inhibiteurs de protéases, qui limitent l'hydrolyse des protéines.
Un tissu doit d'abord être dissocié mécaniquement pour séparer ses cellules et faciliter leur rupture.
La lyse peut être obtenue par cisaillement mécanique, broyage, variations contrôlées de pression ou traitement chimique doux. L'intensité du traitement doit être ajustée : une lyse insuffisante laisse des cellules intactes, tandis qu'une lyse excessive fragmente les organites et mélange leurs contenus.
L'homogénat est d'abord filtré si nécessaire pour éliminer les débris grossiers. Il constitue le matériel de départ de la centrifugation.
Principe physique de la centrifugation
Dans un rotor en rotation, les particules se déplacent vers l'extérieur. Leur sédimentation est d'autant plus rapide qu'elles sont volumineuses, denses par rapport au milieu et de forme compacte. Elle est ralentie lorsque le milieu est visqueux ou lorsque la différence de densité entre la particule et le milieu est faible.
La vitesse de rotation exprimée en tours par minute ne suffit pas à caractériser une centrifugation, car l'accélération dépend aussi du rayon du rotor. Les protocoles sont donc préférentiellement définis par l'accélération centrifuge relative, exprimée comme un multiple de .
Après centrifugation, les particules sédimentées forment le culot au fond du tube. Le liquide restant au-dessus constitue le surnageant.
Centrifugation différentielle
La centrifugation différentielle sépare successivement les constituants selon leur vitesse de sédimentation. L'homogénat subit une série de centrifugations d'intensité croissante.
Les premiers culots contiennent principalement les cellules intactes, les gros débris et les noyaux. Des accélérations intermédiaires sédimentent ensuite les mitochondries, les lysosomes et les peroxysomes. Des accélérations plus fortes permettent de récupérer les petits fragments membranaires, puis les ribosomes et certains complexes macromoléculaires. Le surnageant final correspond à la fraction soluble du cytosol.
Les fragments du réticulum endoplasmique se referment spontanément en petites vésicules lors de l'homogénéisation. Ces structures artificielles sont appelées microsomes : elles n'existent pas sous cette forme dans la cellule intacte.
La séparation reste imparfaite, car des organites différents peuvent avoir des vitesses de sédimentation proches. Une centrifugation différentielle produit donc des fractions enrichies, mais rarement pures.
Centrifugation sur gradient de densité
Le gradient réduit le mélange entre particules et permet leur organisation en bandes distinctes. Deux stratégies doivent être distinguées.
Séparation zonale
Dans la séparation zonale, l'échantillon est déposé au sommet d'un gradient préformé. Les particules avancent à des vitesses différentes et forment des zones. La centrifugation doit être arrêtée avant que les particules les plus rapides n'atteignent le fond du tube.
Cette méthode dépend donc à la fois des propriétés des particules et de la durée de centrifugation.
Séparation isopycnique
Dans la séparation isopycnique, chaque particule migre jusqu'à la région où la densité du milieu devient égale à sa propre densité. Elle ne subit alors plus de déplacement net et forme une bande à sa position d'équilibre.
La durée permet d'atteindre l'équilibre, mais ne détermine plus la position finale. Des particules de tailles différentes peuvent ainsi se retrouver dans la même bande si elles possèdent la même densité de flottation.
Contrôle enzymatique des fractions
Un bon marqueur doit être suffisamment spécifique du compartiment étudié, rester associé à celui-ci pendant la préparation et posséder une activité mesurable. Parmi les marqueurs classiquement utilisés figurent :
- la cytochrome c oxydase pour la membrane interne mitochondriale ;
- la catalase pour les peroxysomes ;
- la phosphatase acide pour les lysosomes ;
- la glucose-6-phosphatase pour le réticulum endoplasmique ;
- la lactate déshydrogénase pour le cytosol ;
- la Na⁺/K⁺-ATPase pour la membrane plasmique.
L'activité mesurée doit être rapportée à la quantité totale de protéines de la fraction. On obtient ainsi une activité spécifique, qui permet de comparer des fractions de concentrations différentes.
Une activité spécifique du marqueur plus élevée que dans l'homogénat traduit un enrichissement en organite cible. La pureté ne peut toutefois pas être conclue à partir du seul marqueur recherché : il faut également doser des marqueurs d'autres compartiments. Leur présence révèle une contamination croisée.
Le rendement correspond à la proportion de l'activité totale initiale retrouvée dans la fraction. Une fraction peut être très enrichie mais obtenue avec un faible rendement si une grande partie des organites a été perdue au cours des étapes.
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