B4 · Méthodes d'étude
Microscopie électronique à transmission et à balayage
Expliquer le gain de résolution obtenu avec un faisceau d'électrons et les contraintes de préparation qui en découlent. Comparer l'information fournie par la transmission et par le balayage.
Biologie cellulaire7 min de lecture17 QCM corrigés
Pourquoi les électrons améliorent-ils la résolution ?
La microscopie électronique utilise un faisceau d’électrons à la place de la lumière visible. Comme les électrons chargés interagissent fortement avec la matière, leur trajectoire peut être accélérée par une différence de potentiel puis focalisée par des lentilles électromagnétiques.
Plus est faible, meilleure est la résolution. La fiche consacrée à la microscopie optique établit le lien entre résolution, longueur d’onde et ouverture du système ; ici, il suffit de retenir qu’une longueur d’onde plus courte permet théoriquement de séparer des détails plus proches.
Dualité onde-particule de l’électron
Un électron possède des propriétés corpusculaires, mais une longueur d’onde lui est également associée. Cette longueur d’onde diminue lorsque la quantité de mouvement de l’électron augmente.
L’accélération des électrons augmente leur quantité de mouvement et réduit donc leur longueur d’onde. Celle-ci devient très inférieure à celle de la lumière visible, ce qui explique le gain majeur de résolution théorique.
La résolution réelle reste cependant moins bonne que celle prédite par la seule longueur d’onde. Elle est aussi limitée par les aberrations des lentilles électromagnétiques, la stabilité du faisceau, les vibrations, la préparation de l’échantillon et le rapport entre le signal utile et le bruit.
Contraintes générales de la microscopie électronique
Travail sous vide
Le faisceau doit parcourir la colonne du microscope sans être diffusé par les molécules de l’air. L’observation conventionnelle impose donc un vide, incompatible avec le maintien d’une cellule vivante dans son état physiologique.
Les échantillons biologiques doivent généralement être :
- immobilisés par fixation ;
- privés de leur eau par déshydratation ;
- stabilisés mécaniquement ou congelés ;
- rendus suffisamment contrastés ou conducteurs selon le microscope utilisé.
Fixation et déshydratation
La fixation vise à préserver aussi fidèlement que possible l’architecture observée au moment du prélèvement. La déshydratation est nécessaire car l’eau liquide se vaporiserait sous vide et perturberait l’échantillon ainsi que la trajectoire des électrons.
Ces traitements peuvent néanmoins déplacer, extraire ou déformer certains constituants. L’image obtenue représente donc un échantillon préparé, et non directement une cellule vivante intacte.
Formation du contraste
Les cellules sont principalement constituées d’atomes légers, qui interagissent relativement peu avec les électrons. Leur contraste spontané est donc faible. Des composés contenant des atomes lourds sont utilisés pour accroître la diffusion des électrons.
Une région qui diffuse fortement les électrons est dite électron-dense. Son apparence dépend ensuite du mode d’imagerie et du type de signal détecté.
Microscopie électronique à transmission
La MET renseigne principalement sur l’organisation interne de la cellule. Les électrons ne pouvant traverser qu’une faible épaisseur de matière, l’échantillon doit être découpé en coupes ultrafines.
Préparation d’un échantillon pour la MET
Lorsque les électrons traversent peu une région parce qu’ils y sont fortement diffusés, moins d’électrons contribuent au signal transmis. Dans la représentation conventionnelle, cette région apparaît sombre. Une région plus transparente aux électrons apparaît claire.
L’image de MET est une projection bidimensionnelle de toute l’épaisseur de la coupe. Des structures placées à des profondeurs différentes peuvent donc se superposer dans l’image. Une reconstruction volumique nécessite plusieurs projections ou l’analyse de coupes successives, procédés qui dépassent l’observation conventionnelle d’une coupe unique.
Microscopie électronique à balayage
En MEB, le faisceau ne traverse pas une coupe ultrafine. Il balaye la surface, et l’intensité recueillie en chaque point sert à construire l’image.
Les électrons secondaires, arrachés aux couches superficielles de l’échantillon, apportent principalement une information sur le relief de surface. Les électrons rétrodiffusés, issus d’une déviation du faisceau incident, dépendent notamment de la composition atomique locale.
Préparation d’un échantillon pour la MEB
La couche conductrice évite l’accumulation locale de charges électriques sur un échantillon biologique naturellement peu conducteur. Une telle accumulation dévierait le faisceau et dégraderait l’image. Le dépôt doit rester mince, car une couche trop épaisse masquerait les détails superficiels.
La MEB produit une image possédant une forte impression de relief grâce aux variations du signal avec l’orientation et la topographie de la surface. Il ne s’agit toutefois pas directement d’un volume mesuré point par point, mais d’une représentation bidimensionnelle codant des informations de surface.
Comparer transmission et balayage
Le choix entre les deux techniques dépend donc de la question morphologique posée. La MET est adaptée à l’analyse de l’ultrastructure interne, tandis que la MEB décrit surtout l’organisation de la surface. Elles ne fournissent pas deux images interchangeables d’un même objet.
Limites d’interprétation
La préparation conventionnelle impose un compromis entre préservation, contraste et résolution. Une fixation insuffisante favorise les déplacements de constituants, tandis qu’une fixation trop intense peut modifier leur organisation. La déshydratation et le séchage peuvent provoquer des rétractions. La coupe peut comprimer ou déchirer l’échantillon, et le faisceau électronique lui-même peut l’endommager.
La cryofixation immobilise rapidement l’échantillon par refroidissement et limite certains déplacements associés aux traitements chimiques. Elle ne supprime cependant ni les contraintes instrumentales ni la nécessité d’interpréter l’image en fonction du protocole employé.
La microscopie électronique fournit avant tout une information morphologique. L’identification spécifique d’une molécule exige un marquage adapté, notion traitée dans la fiche consacrée aux immunomarquages.
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