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Sommaire

  • 1Principe général de l’électrophorèse
  • 2De la force électrique à la vitesse de migration
    • 2.1Résistance mécanique du milieu
  • 3Origine de la séparation
    • 3.1Propriétés de la particule
    • 3.2Rôle du support poreux
    • 3.3Influence du milieu tamponné lock — section verrouillée
    • 3.4Champ, durée et diffusion lock — section verrouillée
  • 4Principaux modes de séparation lock — section verrouillée
  • 5Lecture d’un profil électrophorétique lock — section verrouillée
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  5. Électrophorèse : principe physique et applications biologiques

B7 · Électrophysiologie

Électrophorèse : principe physique et applications biologiques

Relier la migration d'une particule chargée au champ appliqué, à sa charge et à la résistance du milieu. Décrire les paramètres qui gouvernent une séparation et l'interprétation d'un profil électrophorétique.

Biophysique·schedule8 min de lecture·quiz17 QCM corrigés

Principe général de l’électrophorèse

Définition

Électrophorèse

Technique de séparation dans laquelle des particules chargées migrent sous l’action d’un champ électrique au sein d’un milieu liquide ou d’un support poreux.

Le champ électrique E⃗\vec EE décrit l’action électrique locale exercée sur une charge. Son lien avec le potentiel électrique est étudié dans la fiche consacrée à l’électrostatique. Dans une cuve d’électrophorèse, l’anode est l’électrode positive et la cathode l’électrode négative. Le champ est orienté de l’anode vers la cathode.

Une particule de charge électrique qqq subit une force F⃗e\vec F_{\mathrm e}Fe​ proportionnelle au champ :

Formule

Force électrique

F⃗e=qE⃗\vec F_{\mathrm e}=q\vec EFe​=qE
  • F⃗e\vec F_{\mathrm e}Fe​ : force électrique exercée sur la particule, en newtons
  • qqq : charge électrique de la particule, en coulombs
  • E⃗\vec EE : champ électrique, en volts par mètre

Une particule positive se déplace dans le sens de E⃗\vec EE, donc vers la cathode. Une particule négative se déplace en sens opposé, donc vers l’anode. Une particule de charge nette nulle ne possède pas de migration électrophorétique propre.

De la force électrique à la vitesse de migration

Résistance mécanique du milieu

Le milieu s’oppose au mouvement par une force de frottement. Aux faibles vitesses rencontrées en électrophorèse, cette force est approximativement proportionnelle à la vitesse :

F⃗f=−fv⃗\vec F_{\mathrm f}=-f\vec vFf​=−fv

où F⃗f\vec F_{\mathrm f}Ff​ est la force de frottement, fff le coefficient de frottement et v⃗\vec vv la vitesse de migration. Le signe négatif indique que le frottement s’oppose au mouvement.

Après une phase transitoire très brève, la force électrique et le frottement se compensent. La particule atteint alors une vitesse limite constante.

Formule

Vitesse électrophorétique

v⃗=qfE⃗\vec v=\frac{q}{f}\vec Ev=fq​E
  • v⃗\vec vv : vitesse électrophorétique de la particule, en mètres par seconde
  • qqq : charge électrique effective de la particule, en coulombs
  • fff : coefficient de frottement, en kilogrammes par seconde
  • E⃗\vec EE : champ électrique, en volts par mètre

La migration est donc d’autant plus rapide que la charge effective est grande et que le frottement est faible. Le coefficient fff augmente notamment avec la viscosité du milieu, la taille hydrodynamique de la particule et les obstacles rencontrés.

Pour une particule sphérique de rayon hydrodynamique rrr se déplaçant dans un liquide homogène de viscosité dynamique η\etaη, la loi de Stokes donne f=6πηrf=6\pi\eta rf=6πηr. Cette relation éclaire l’effet de la taille, mais elle ne décrit pas à elle seule la migration dans un gel poreux.

Définition

Mobilité électrophorétique μ\muμ

Rapport entre la vitesse électrophorétique d’une particule et le champ électrique appliqué, soit μ=v/E\mu=v/Eμ=v/E. Son signe traduit le sens de migration par rapport au champ.

Formule

Mobilité et distance de migration

μ=vE=qfetd=μEt\mu=\frac{v}{E}=\frac{q}{f} \qquad\text{et}\qquad d=\mu Etμ=Ev​=fq​etd=μEt
  • μ\muμ : mobilité électrophorétique, en mètres carrés par volt et par seconde
  • vvv : composante de la vitesse dans la direction du champ, en mètres par seconde
  • EEE : valeur du champ électrique, en volts par mètre
  • qqq : charge électrique effective, en coulombs
  • fff : coefficient de frottement, en kilogrammes par seconde
  • ddd : distance algébrique de migration, en mètres
  • ttt : durée de migration, en secondes
Exemple

Calculer une distance de migration

Une particule porte une charge effective positive et possède une mobilité électrophorétique μ=3,0×10−8 m2 V−1 s−1\mu = \pu{3,0 \times 10^{-8} m^2 V^{-1} s^{-1}}μ=3,0×10−8 m2V−1s−1. Elle est soumise pendant t=300 st = \pu{300 s}t=300 s à un champ uniforme de valeur E=200 V/mE = \pu{200 V/m}E=200 V/m.

La distance de migration vaut :

d=μEtd = \mu E td=μEtd=3,0×10−8 m2 V−1 s−1×200 V/m×300 sd = \pu{3,0 \times 10^{-8} m^2 V^{-1} s^{-1}} \times \pu{200 V/m} \times \pu{300 s}d=3,0×10−8 m2V−1s−1×200 V/m×300 sd=1,8×10−3 m=1,8 mmd = \pu{1,8 \times 10^{-3} m} = \pu{1,8 mm}d=1,8×10−3 m=1,8 mm

La particule migre de 1,8 mm\pu{1,8 mm}1,8 mm vers la cathode. Sa mobilité étant positive, son déplacement est dans le sens du champ électrique.

La relation sur la distance suppose un champ uniforme, une mobilité constante et l’absence d’écoulement global du liquide.

Attention

Résistance électrique et frottement ne sont pas synonymes

La résistance électrique du dispositif gouverne le courant traversant le milieu. La résistance au déplacement d’une particule correspond au coefficient de frottement fff. Elle dépend de la viscosité, de la taille, de la forme et du support.

Origine de la séparation

Deux espèces sont séparées si leurs mobilités électrophorétiques sont différentes. La mobilité résulte du rapport entre leur charge effective et leur frottement.

Propriétés de la particule

La migration dépend de plusieurs caractéristiques :

  • la charge nette, qui fixe l’intensité et le sens de la force électrique ;
  • la taille hydrodynamique, qui influence le frottement ;
  • la forme, car une particule allongée ou compacte ne rencontre pas la même résistance ;
  • les interactions avec le solvant, les ions et le support ;
  • l’état d’association ou la conformation de la particule.

La charge effective peut être inférieure à la charge structurale, car les ions du milieu forment autour de la particule une atmosphère ionique qui modifie l’action du champ.

Rôle du support poreux

Définition

Tamisage moléculaire

Effet d’un réseau poreux qui ralentit davantage les particules rencontrant le plus d’obstacles lors de leur migration.

Dans un gel, la taille des pores dépend de la nature et de la concentration du réseau. Des pores plus petits renforcent la discrimination selon la taille, mais peuvent empêcher la progression des particules les plus volumineuses. Le gel limite également les mouvements convectifs et stabilise les zones séparées.

Influence du milieu tamponné

Définition

Tampon d’électrophorèse

Solution ionique maintenant approximativement constantes le pH et la conductivité pendant la migration.

Le pH modifie l’ionisation des groupes acides et basiques, donc la charge nette des molécules biologiques. Pour une protéine, le point isoélectrique, noté pIpIpI, est le pH auquel la charge nette moyenne est nulle. Si le pH est inférieur au pIpIpI, la charge moyenne est positive ; s’il lui est supérieur, elle est négative.

La force ionique influence l’écrantage des charges et la conductivité. Une conductivité élevée augmente le courant à champ donné et favorise l’échauffement par effet Joule. Cet échauffement diminue la viscosité, peut perturber la structure des molécules et crée des gradients qui déforment les zones de migration.

Champ, durée et diffusion

Augmenter le champ accroît la vitesse, mais augmente généralement aussi l’échauffement. Prolonger la migration augmente les distances parcourues, tout en laissant davantage de temps à la diffusion, mouvement aléatoire responsable de l’élargissement des zones.

Définition

Résolution électrophorétique

Capacité du dispositif à distinguer deux espèces de mobilités voisines sous la forme de zones séparées.

Une bonne résolution exige une différence suffisante de mobilité et des zones étroites. Elle dépend donc du champ, de la durée, du support, de la température, de la diffusion et de la quantité déposée.

À retenir

La séparation ne dépend pas isolément de la charge ou de la taille : elle dépend de la mobilité μ=q/f\mu=q/fμ=q/f, donc du rapport entre force électrique et résistance mécanique du milieu.

Principaux modes de séparation

Comparaison

Modes physiques d’électrophorèse

CritèreÉlectrophorèse en conditions nativesÉlectrophorèse dénaturanteFocalisation isoélectrique
Propriété dominantecharge, taille et formetaille apparente après uniformisation du rapport charge sur massepoint isoélectrique
Structure moléculaireglobalement conservéeconformation modifiéecharge variant avec le gradient de pH
Position finaledéterminée par la mobilité et la duréedéterminée surtout par le tamisagezone où le pH est égal au pIpIpI

En conditions natives, plusieurs propriétés varient simultanément : une différence de position ne peut donc pas être attribuée automatiquement à une différence de taille. En conditions dénaturantes, le traitement vise à réduire l’influence de la conformation et de la charge propre afin de privilégier une séparation selon la taille apparente.

Dans la focalisation isoélectrique, un gradient de pH est établi. Une protéine migre tant qu’elle porte une charge nette. Lorsqu’elle atteint la zone où le pH égale son pIpIpI, sa charge nette s’annule et sa migration propre cesse. Si elle diffuse hors de cette zone, elle retrouve une charge qui la ramène vers son point isoélectrique, d’où le terme de focalisation.

En électrophorèse capillaire, le liquide peut aussi se déplacer globalement sous l’effet du champ : c’est le flux électro-osmotique. La vitesse observée associe alors la migration propre de la particule et le déplacement du liquide.

Lecture d’un profil électrophorétique

Définition

Profil électrophorétique

Représentation de la répartition des espèces séparées selon leur position de migration ou leur temps d’arrivée au détecteur.

Sur un support, une bande correspond à une zone où le signal est concentré. En capillaire, le profil apparaît sous forme de pics successifs. Leur position renseigne sur la mobilité apparente ; leur intensité ou leur aire peut renseigner sur la quantité, à condition que la détection soit linéaire et comparable entre les mesures.

Méthode

Interpréter un profil électrophorétique

  1. Identifier le sens du champ, la polarité des électrodes et le point de dépôt
  2. Vérifier les conditions de séparation, notamment le pH, le support, le champ et la durée
  3. Relier chaque position ou temps de migration à une mobilité apparente
  4. Évaluer la netteté, la largeur et la séparation des bandes ou des pics
  5. Comparer les intensités uniquement si les conditions de détection sont identiques et non saturées
  6. Rechercher une éventuelle comigration avant d’attribuer une zone à une seule espèce

Une bande unique ne démontre pas nécessairement la présence d’une seule espèce : plusieurs particules de mobilités proches peuvent comigrer. À l’inverse, une bande diffuse peut traduire une hétérogénéité, une diffusion importante, une quantité excessive ou des conditions instables.

Attention

Position et quantité sont deux informations différentes

La position d’une zone renseigne d’abord sur sa mobilité apparente. Son intensité renseigne sur la réponse du détecteur et ne devient une mesure quantitative qu’après vérification de la linéarité et des conditions de comparaison.

Les applications biologiques reposent sur la séparation de mélanges de protéines, d’acides nucléiques ou d’autres particules chargées. Selon les conditions, l’électrophorèse permet d’étudier leur hétérogénéité, leur pureté apparente, leur taille, leur charge ou leur point isoélectrique. Les protocoles analytiques propres aux protéines et aux acides nucléiques sont détaillés dans les fiches de biochimie et de biologie moléculaire correspondantes.

Points clés
  • Une particule chargée subit la force électrique F⃗e=qE⃗\vec F_{\mathrm e}=q\vec EFe​=qE et une force de frottement opposée au mouvement
  • La vitesse limite vérifie v⃗=qE⃗/f\vec v=q\vec E/fv=qE/f et la mobilité électrophorétique vaut μ=q/f\mu=q/fμ=q/f
  • Le sens de migration dépend du signe de la charge, tandis que la vitesse dépend de la charge effective et du frottement
  • La séparation est gouvernée par la charge, la taille, la forme, le pH, le support, le champ, la température et la diffusion
  • La position d’une bande ou d’un pic renseigne sur la mobilité apparente, alors que son intensité dépend aussi du système de détection
  • Une zone électrophorétique peut contenir plusieurs espèces ayant des mobilités voisines

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  • Fiche 01Électrostatique, potentiel et dipôle électriqueÉlectrophysiologie
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