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Sommaire

  • 1Principe général de la culture cellulaire
  • 2Conditions nécessaires à la culture
    • 2.1Milieu nutritif
    • 2.2Environnement physique
    • 2.3Asepsie et surveillance
    • 2.4Densité et repiquage
  • 3Cultures primaires et lignées cellulaires
    • 3.1Culture primaire
    • 3.2Lignée cellulaire lock — section verrouillée
  • 4Tester le rôle d’une protéine lock — section verrouillée
    • 4.1Perte de fonction lock — section verrouillée
    • 4.2Gain et restauration de fonction lock — section verrouillée
    • 4.3Mesures fonctionnelles lock — section verrouillée
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B4 · Méthodes d'étude

Culture cellulaire et modèles fonctionnels

Décrire les conditions de culture des cellules, les lignées primaires et immortalisées et leurs limites. Présenter les approches fonctionnelles permettant de tester le rôle d'une protéine dans un modèle cellulaire.

Biologie cellulaire·schedule7 min de lecture·quiz17 QCM corrigés

Principe général de la culture cellulaire

Définition

Culture cellulaire

Maintien et multiplication de cellules vivantes hors de l’organisme, dans un environnement artificiel contrôlé qui leur apporte les conditions physiques, chimiques et biologiques nécessaires.

La culture cellulaire permet d’observer directement des phénomènes cellulaires et de modifier une variable de façon contrôlée. Elle simplifie cependant l’environnement naturel de la cellule, qui dépend normalement d’interactions avec d’autres cellules, avec la matrice extracellulaire et avec des signaux circulants.

Une culture peut être réalisée :

  • en suspension, lorsque les cellules restent libres dans le milieu ;
  • en adhérence, lorsqu’elles doivent se fixer à une surface pour survivre et proliférer ;
  • en organisation bidimensionnelle, sur une surface plane ;
  • en organisation tridimensionnelle, dans une matrice ou sous forme d’agrégats, afin de mieux reproduire les interactions spatiales.

Conditions nécessaires à la culture

Milieu nutritif

Définition

Milieu de culture

Solution nutritive dont la composition vise à maintenir la survie, le métabolisme et, si nécessaire, la prolifération des cellules cultivées.

Le milieu contient notamment :

  • de l’eau et des ions, qui déterminent l’équilibre osmotique ;
  • des substrats énergétiques et des précurseurs de biosynthèse ;
  • des acides aminés et des vitamines ;
  • un système tampon maintenant le pH compatible avec l’activité cellulaire ;
  • des facteurs de croissance et des hormones adaptés au type cellulaire.

Certains milieux reçoivent du sérum, mélange complexe apportant des protéines, des facteurs de croissance et des molécules d’adhérence. Sa composition étant imparfaitement définie et variable, il réduit la reproductibilité. Les milieux chimiquement définis permettent au contraire de connaître précisément les constituants auxquels les cellules sont exposées.

Environnement physique

La température doit être maintenue dans une plage compatible avec l’origine des cellules. L’atmosphère de l’incubateur contrôle notamment l’humidité et la concentration en dioxyde de carbone, lorsque celui-ci participe au tamponnement du milieu.

Le pH, l’osmolarité et la disponibilité en dioxygène doivent rester suffisamment stables. Une concentration en dioxygène inadaptée peut modifier le métabolisme, la prolifération et l’expression des gènes, même si les cellules restent vivantes.

Les cellules adhérentes nécessitent une surface favorable à leur fixation. Celle-ci peut être recouverte de constituants de la matrice extracellulaire afin de fournir des signaux d’adhérence plus proches de ceux du tissu.

Asepsie et surveillance

Définition

Asepsie

Ensemble des mesures destinées à empêcher l’introduction de micro-organismes dans une culture.

Les manipulations sont réalisées avec du matériel stérile dans une enceinte protégeant la préparation. La culture doit être régulièrement surveillée pour détecter les bactéries, les champignons et les mycoplasmes. Ces derniers peuvent rester peu visibles tout en modifiant profondément le métabolisme et l’expression des gènes.

L’emploi d’antibiotiques ne remplace pas l’asepsie : il peut masquer une contamination sans supprimer toutes ses conséquences.

Densité et repiquage

Définition

Confluence

Proportion de la surface de culture occupée par des cellules adhérentes.

La densité cellulaire influence les contacts entre cellules, l’accès aux nutriments et la prolifération. Une culture trop dense peut subir une inhibition de contact, une différenciation ou un épuisement du milieu.

Définition

Repiquage

Transfert d’une fraction des cellules vers un nouveau récipient contenant du milieu frais, afin de poursuivre leur culture à une densité appropriée.

Pour des cellules adhérentes, le repiquage nécessite leur détachement mécanique ou enzymatique. Chaque repiquage constitue un passage. Le nombre de passages doit être suivi, car les propriétés cellulaires peuvent dériver au cours du temps.

Exemple

Prélever une fraction de culture lors d’un repiquage

Une culture adhérente a été détachée puis remise en suspension dans 6,0 mL\pu{6,0 mL}6,0 mL de milieu. Le dénombrement indique 1,2×1061{,}2 \times 10^61,2×106 cellules au total.

Pour ensemencer un nouveau récipient avec un sixième de la culture, un volume de 1,0 mL\pu{1,0 mL}1,0 mL est prélevé :

1,06,0×1,2×106=2,0×105\frac{1{,}0}{6{,}0} \times 1{,}2 \times 10^6 = 2{,}0 \times 10^56,01,0​×1,2×106=2,0×105

Le nouveau récipient reçoit donc 2,0×1052{,}0 \times 10^52,0×105 cellules dans du milieu frais. Ce transfert vers un nouveau récipient constitue un passage ; le numéro de passage est ensuite augmenté d’une unité dans le suivi de la culture.

Méthode

Entretenir une culture cellulaire

  1. Vérifier l’identité, l’aspect et l’absence de contamination de la culture
  2. Contrôler la densité cellulaire et l’état du milieu
  3. Détacher les cellules adhérentes si nécessaire
  4. Recueillir et dénombrer les cellules
  5. Réensemencer une fraction définie dans un milieu neuf
  6. Noter le numéro de passage et les conditions expérimentales

Cultures primaires et lignées cellulaires

Culture primaire

Définition

Culture primaire

Culture obtenue directement à partir de cellules prélevées dans un tissu, avant leur propagation prolongée hors de l’organisme.

Les cellules primaires conservent généralement mieux certaines propriétés du tissu d’origine. Elles sont toutefois hétérogènes, difficiles à standardiser et souvent exigeantes en facteurs de survie. Leur capacité de division est limitée : après un nombre fini de divisions, elles peuvent entrer en sénescence réplicative, état stable d’arrêt de prolifération.

Lignée cellulaire

Définition

Lignée cellulaire

Population issue de cellules cultivées et propagée au fil de passages successifs, avec des caractéristiques suffisamment stables pour constituer un modèle expérimental.

Une lignée à durée de vie limitée conserve une capacité de prolifération finie. Une lignée immortalisée peut se multiplier durablement grâce à la levée de mécanismes limitant normalement la prolifération. L’immortalisation peut être spontanée ou provoquée par une modification biologique.

Une cellule immortalisée n’est pas nécessairement tumorale. La transformation cellulaire correspond à l’acquisition d’anomalies plus larges du contrôle de la croissance, de la survie ou de l’organisation cellulaire.

Comparaison

Cultures primaires et lignées immortalisées

CritèreCulture primaireLignée immortalisée
Proximité avec le tissu d’originegénéralement élevéesouvent réduite par l’adaptation à la culture
Capacité de proliférationlimitéedurable
Hétérogénéitésouvent importantegénéralement plus faible
Reproductibilitéplus difficilegénéralement meilleure
Risque de dérivesénescence et sélection rapidedérive génétique et phénotypique au fil des passages
Attention

Une lignée n’est pas le tissu entier

Une lignée cellulaire reproduit seulement une partie des propriétés d’un tissu. L’absence de vascularisation, d’innervation, de matrice complète et d’interactions entre populations cellulaires limite l’extrapolation à l’organisme.

À retenir

L’identité d’une lignée, son numéro de passage, son état de différenciation et l’absence de contamination doivent être contrôlés : une expérience techniquement correcte n’est interprétable que si le modèle est fiable.

Tester le rôle d’une protéine

L’objectif d’une étude fonctionnelle est d’établir un lien causal entre l’activité d’une protéine et un phénotype cellulaire, c’est-à-dire une propriété mesurable de la cellule. Le raisonnement repose principalement sur la perte de fonction, le gain de fonction et la restauration de fonction.

Perte de fonction

La perte de fonction consiste à diminuer ou supprimer l’activité de la protéine étudiée. Elle peut être obtenue par :

  • réduction de la quantité de son ARN messager ;
  • invalidation ou modification du gène correspondant ;
  • inhibition de l’activité de la protéine ;
  • dégradation ciblée de la protéine.

Les mécanismes détaillés de l’interférence par ARN et de l’édition génomique sont étudiés dans les fiches de biologie moléculaire correspondantes.

Si la perturbation modifie un phénotype, la protéine participe probablement au processus étudié. Cette conclusion reste provisoire, car la manipulation peut agir sur d’autres cibles ou déclencher une adaptation indirecte.

Gain et restauration de fonction

Définition

Gain de fonction expérimental

Augmentation de la quantité ou de l’activité d’une protéine afin de déterminer si elle suffit à provoquer ou renforcer un phénotype.

Le gain de fonction repose souvent sur l’introduction d’un acide nucléique permettant l’expression de la protéine. Une transfection introduit artificiellement cet acide nucléique dans les cellules, tandis qu’une transduction utilise un vecteur d’origine virale.

L’expression est transitoire si elle disparaît après un temps limité. Elle est stable si l’information introduite est maintenue au cours des divisions cellulaires.

La restauration de fonction consiste à réintroduire une version fonctionnelle de la protéine après une perte de fonction. La réapparition du phénotype initial renforce fortement l’interprétation causale.

Méthode

Construire une étude fonctionnelle

  1. Choisir un modèle exprimant les partenaires nécessaires au processus étudié
  2. Définir une perturbation de perte ou de gain de fonction
  3. Prévoir un témoin ne modifiant pas spécifiquement la protéine ciblée
  4. Vérifier que la perturbation modifie réellement la quantité ou l’activité de la protéine
  5. Mesurer un ou plusieurs phénotypes cellulaires pertinents
  6. Réaliser si possible une restauration de fonction
  7. Répéter l’étude avec une stratégie indépendante afin d’écarter un effet non spécifique

Mesures fonctionnelles

Les conséquences de la perturbation peuvent être évaluées par des mesures de :

  • survie, prolifération ou mort cellulaire ;
  • différenciation et expression de marqueurs ;
  • morphologie, polarité ou adhérence ;
  • migration et dynamique du cytosquelette ;
  • activité métabolique ou réponse à un signal ;
  • localisation cellulaire et interactions moléculaires.

La microscopie, les immunomarquages et la cytométrie en flux fournissent certains de ces résultats, mais leurs principes sont traités dans les fiches voisines du sous-bloc.

Attention

Corrélation et causalité

La présence simultanée d’une protéine et d’un phénotype constitue une corrélation. La causalité exige une perturbation contrôlée, la vérification de son efficacité, des témoins adaptés et, idéalement, une restauration de fonction.

À retenir

Une protéine est dite nécessaire si sa perte empêche le phénomène ; elle est dite suffisante si son gain de fonction provoque le phénomène dans un contexte cellulaire approprié. Nécessité et suffisance sont deux conclusions distinctes.

Points clés
  • La culture cellulaire exige un milieu adapté, un environnement physicochimique stable et une asepsie rigoureuse
  • Les cultures primaires sont proches du tissu d’origine mais limitées par leur hétérogénéité et leur durée de vie
  • Les lignées immortalisées sont faciles à propager mais peuvent subir des dérives génétiques et phénotypiques
  • La perte de fonction teste principalement la nécessité d’une protéine, tandis que le gain de fonction teste sa suffisance
  • Une restauration de fonction et des stratégies indépendantes renforcent l’interprétation causale
  • Aucun modèle cellulaire ne reproduit à lui seul toute la complexité d’un tissu ou d’un organisme

Fiches connexes

À réviser dans la foulée, sur Méthodes d'étude.

  • Fiche 01Microscopie optique : principes, contraste et fluorescenceMéthodes d'étude
  • Fiche 02Microscopie électronique à transmission et à balayageMéthodes d'étude
  • Fiche 03Immunomarquages : immunohistochimie et immunofluorescenceMéthodes d'étude
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    • 4.1Perte de fonction lock — section verrouillée
    • 4.2Gain et restauration de fonction lock — section verrouillée
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