B4 · Méthodes d'étude
Cytométrie en flux
Décrire le principe de l'analyse cellule par cellule en flux et les paramètres de diffusion et de fluorescence mesurés. Expliquer la lecture d'un histogramme et d'un nuage de points et l'usage du tri cellulaire.
Biologie cellulaire7 min de lecture17 QCM corrigés
Principe général de la cytométrie en flux
L'échantillon doit former une suspension de particules individualisées. Chaque particule traversant la zone de mesure produit des signaux enregistrés comme un événement. Un événement peut correspondre à une cellule, mais aussi à un débris ou à plusieurs cellules accolées. L'identification des cellules pertinentes nécessite donc une sélection informatique ultérieure.
L'appareil associe trois systèmes complémentaires :
- un système fluidique, qui entraîne et aligne les cellules ;
- un système optique, qui éclaire les cellules et recueille la lumière ;
- un système électronique et informatique, qui transforme les signaux lumineux en données numériques.
Alignement et passage des cellules
La suspension cellulaire est injectée dans un liquide d'entraînement. Les différences de vitesse entre les couches de liquide recentrent l'échantillon et organisent les cellules en une file étroite : c'est la focalisation hydrodynamique.
Les cellules passent ainsi successivement dans une zone d'interrogation où elles rencontrent un ou plusieurs faisceaux laser. Cette organisation limite le passage simultané de plusieurs cellules, sans le supprimer totalement.
Signaux optiques mesurés
Diffusion de la lumière
Deux paramètres de diffusion sont principalement mesurés.
La diffusion vers l'avant, notée FSC, est recueillie dans une direction proche de celle du faisceau incident. Elle est principalement corrélée à la taille apparente de la cellule.
La diffusion latérale, notée SSC, est recueillie approximativement perpendiculairement au faisceau. Elle est principalement corrélée à la complexité interne de la cellule : granulations, organisation du cytoplasme et hétérogénéité des structures intracellulaires.
Fluorescence
Un fluorochrome peut être associé à une sonde reconnaissant une molécule cellulaire. Le principe moléculaire du marquage est développé dans la fiche consacrée aux immunomarquages ; en cytométrie, l'objectif est de quantifier la fluorescence de chaque événement.
La lumière émise est séparée selon ses longueurs d'onde par des filtres optiques, puis dirigée vers des détecteurs. Chaque détecteur correspond à un canal de fluorescence. L'emploi simultané de plusieurs canaux permet une analyse multiparamétrique, c'est-à-dire la mesure de plusieurs propriétés sur une même cellule.
Impulsion et intensité du signal
Lorsqu'une cellule traverse le faisceau, elle produit une impulsion brève. Celle-ci peut être décrite par sa hauteur, sa surface et sa largeur. La surface représente l'intensité totale recueillie pendant le passage.
La comparaison entre surface et largeur permet notamment de repérer des événements formés de plusieurs cellules accolées. Cette exclusion des événements multiples améliore la fiabilité d'une analyse réellement cellule par cellule.
Conditions d'une mesure interprétable
La qualité des résultats dépend d'abord de la préparation de l'échantillon. La suspension doit contenir des cellules suffisamment individualisées, en bon état et à une concentration compatible avec leur passage successif. Les amas augmentent le risque que plusieurs cellules soient enregistrées comme un seul événement.
L'autofluorescence est la fluorescence naturellement émise par certains constituants cellulaires, en l'absence de fluorochrome ajouté. Elle contribue au signal de fond et doit être distinguée de la fluorescence spécifique.
Les spectres d'émission des fluorochromes peuvent se chevaucher. Une partie du signal destiné à un canal est alors détectée dans un autre canal.
La compensation est déterminée à l'aide de contrôles ne portant qu'un fluorochrome à la fois. Un contrôle sans marquage permet d'estimer l'autofluorescence et le bruit de fond. Ces contrôles sont indispensables pour placer correctement les limites entre événements faiblement et fortement fluorescents.
Lecture des représentations graphiques
Histogramme
Un histogramme étudie donc un paramètre à la fois. La position d'une population sur l'axe horizontal renseigne sur l'intensité du signal, tandis que la largeur de la distribution renseigne sur son hétérogénéité.
L'intensité peut être représentée sur une échelle linéaire ou logarithmique. Une échelle logarithmique est utile lorsque les valeurs couvrent une grande étendue. La fluorescence d'une population est souvent résumée par une intensité centrale, notamment la médiane, moins sensible aux valeurs extrêmes que la moyenne.
Un seuil peut séparer une zone considérée comme négative d'une zone considérée comme positive. Ce seuil ne doit pas être fixé arbitrairement : il dépend des contrôles et du bruit de fond.
Nuage de points
Le nuage de points révèle des regroupements d'événements correspondant à des populations aux propriétés proches. Il permet d'étudier simultanément deux signaux de diffusion, deux fluorescences, ou une diffusion et une fluorescence.
Des lignes peuvent partager le graphique en régions. Une représentation en quatre quadrants distingue alors les événements faibles ou élevés pour chacun des deux paramètres. Toutefois, les limites de ces régions doivent être établies à partir des contrôles et de la distribution réelle des signaux.
Sélection des populations
La sélection est généralement séquentielle : exclusion des débris, choix de la population cellulaire, élimination des événements multiples, puis analyse des fluorescences. Une sélection effectuée à une étape conditionne toutes les représentations suivantes.
Tri cellulaire
Après l'analyse optique, le jet liquide est fragmenté en gouttelettes. Lorsqu'une gouttelette contient une cellule répondant aux critères choisis, elle reçoit une charge électrique. Son passage entre des plaques chargées entraîne sa déviation vers un récipient de collecte. Les gouttelettes non sélectionnées suivent une autre trajectoire.
Le tri peut séparer plusieurs populations au cours d'une même procédure. Sa qualité est évaluée par :
- la pureté, proportion de cellules attendues dans la fraction recueillie ;
- le rendement, proportion de cellules recherchées effectivement récupérées ;
- la viabilité, maintien de l'intégrité fonctionnelle des cellules après le tri ;
- la vitesse, nombre d'événements traités par unité de temps.
Une vitesse élevée augmente le débit, mais peut accroître les passages simultanés et réduire la précision. Le réglage résulte donc d'un compromis entre pureté, rendement, viabilité et durée.
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