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Sommaire

  • 1Isoenzymes et distribution tissulaire
    • 1.1Définition moléculaire
    • 1.2Distribution tissulaire
  • 2Mesure de l'activité enzymatique
    • 2.1Activité catalytique et vitesse de réaction
    • 2.2Unités
  • 3Principes analytiques lock — section verrouillée
    • 3.1Mesure directe, indirecte et couplée lock — section verrouillée
  • 4Paramètres influençant la mesure lock — section verrouillée
    • 4.1Température et pH lock — section verrouillée
    • 4.2Composition du milieu lock — section verrouillée
    • 4.3Standardisation et interprétation lock — section verrouillée
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B2 · Enzymologie

Isoenzymes, mesure de l'activité et intérêt diagnostique

Définir une isoenzyme et expliquer l'intérêt de sa distribution tissulaire en biologie clinique. Décrire la mesure d'une activité enzymatique, ses unités et les paramètres physiques qui l'influencent.

Biochimie structurale et métabolique·schedule7 min de lecture·quiz17 QCM corrigés

Isoenzymes et distribution tissulaire

Définition moléculaire

Définition

Isoenzyme

Forme moléculaire distincte d'une enzyme qui catalyse la même réaction globale qu'une autre forme, mais qui en diffère par sa structure, ses propriétés physicochimiques, sa régulation ou sa distribution tissulaire.

Les isoenzymes reconnaissent donc les mêmes substrats principaux et conduisent aux mêmes produits, sans être nécessairement identiques. Leur diversité peut résulter de plusieurs mécanismes :

  • expression de gènes distincts issus d'une même famille génique ;
  • association différente de plusieurs types de sous-unités ;
  • maturation ou modification post-traductionnelle d'une protéine ;
  • expression variable selon le tissu ou le stade du développement.

Ces différences structurales peuvent modifier la charge électrique, la masse moléculaire, la stabilité, l'affinité apparente pour le substrat ou la sensibilité à certains effecteurs. Elles permettent de distinguer les isoenzymes par électrophorèse, chromatographie, immunodosage ou mesure sélective de leur activité.

Comparaison

Enzyme, isoenzyme et isoforme

NotionDéfinitionCritère distinctif
EnzymeCatalyseur biologique d'une réaction déterminéeFonction catalytique
IsoenzymeForme moléculaire catalysant la même réaction qu'une autre formePropriétés et distribution tissulaire
IsoformeVariante moléculaire d'une même protéineNe possède pas nécessairement la même activité catalytique

La cinétique michaélienne et les paramètres KmK_mKm​ et Vmax⁡V_{\max}Vmax​ sont étudiés dans la fiche consacrée à la cinétique enzymatique ; ici, ils interviennent seulement comme propriétés susceptibles de différer entre isoenzymes.

Distribution tissulaire

La distribution tissulaire désigne la répartition quantitative des différentes isoenzymes entre les organes, les tissus et les compartiments cellulaires. Un même tissu peut contenir plusieurs isoenzymes, tandis qu'une même isoenzyme peut être présente dans plusieurs tissus. La spécificité tissulaire est donc généralement relative, et non absolue.

Dans une cellule intacte, les enzymes sont localisées dans le cytosol, les mitochondries, les lysosomes, les membranes ou d'autres compartiments. Une altération cellulaire peut augmenter leur passage dans le milieu extracellulaire puis dans le sang. L'activité enzymatique circulante dépend alors de plusieurs phénomènes :

  • abondance de l'enzyme dans le tissu ;
  • localisation intracellulaire ;
  • importance et durée de la libération ;
  • vitesse de renouvellement cellulaire ;
  • stabilité de l'enzyme dans le sang ;
  • vitesse de son élimination.

L'identification de l'isoenzyme majoritairement augmentée peut ainsi fournir une information sur l'origine tissulaire de l'activité totale mesurée. Elle améliore la spécificité diagnostique, car une augmentation de l'activité enzymatique totale ne permet pas toujours de reconnaître le tissu responsable.

À retenir

Intérêt diagnostique des isoenzymes

L'activité enzymatique totale indique qu'une réaction catalytique est accrue dans l'échantillon ; le profil des isoenzymes aide à déterminer l'origine tissulaire de cette augmentation.

Attention

Une isoenzyme n'est pas toujours spécifique d'un seul organe

Une prédominance tissulaire ne signifie pas une exclusivité. L'interprétation doit tenir compte de l'ensemble du profil enzymatique, du contexte biologique et de l'évolution temporelle.

Mesure de l'activité enzymatique

Activité catalytique et vitesse de réaction

Définition

Activité catalytique

Quantité de substrat transformée, ou de produit formé, par une enzyme pendant une unité de temps, dans des conditions expérimentales définies.

L'activité ne mesure pas directement le nombre de molécules d'enzyme. Elle mesure leur effet catalytique. Deux échantillons contenant la même quantité d'enzyme peuvent donc présenter des activités différentes si l'enzyme est partiellement inactive, inhibée ou placée dans des conditions différentes.

Formule

Activité catalytique

a=dξdta = \frac{\mathrm{d}\xi}{\mathrm{d}t}a=dtdξ​
  • aaa : activité catalytique
  • ξ\xiξ : avancement de la réaction, en moles
  • ttt : temps, en secondes

La mesure est préférentiellement effectuée au début de la réaction, lorsque la vitesse est approximativement constante. Cette vitesse initiale limite l'influence de l’épuisement du substrat, de l’accumulation des produits et des réactions inverses.

Définition

Concentration d'activité catalytique

Activité catalytique rapportée au volume de l'échantillon analysé.

Formule

Concentration d'activité catalytique

b=aVb = \frac{a}{V}b=Va​
  • bbb : concentration d'activité catalytique, en katal par litre ou en unité enzymatique par litre
  • aaa : activité catalytique, en katal ou en unité enzymatique
  • VVV : volume de l'échantillon, en litres
Exemple

Calculer une concentration d'activité catalytique

Une prise d'essai de sérum de 100 μL\pu{100 \mu L}100 μL transforme 0 ,25 μmol\pu{0{,}25 \mu mol}0 ,25μmol de substrat en 2 min\pu{2 min}2 min, dans les conditions du dosage.

  • Activité de la prise d'essai :
a=0 ,25 μmol2 min=0 ,125 μmol ⋅ min−1=0 ,125 Ua = \frac{\pu{0{,}25 \mu mol}}{\pu{2 min}} = \pu{0{,}125 \mu mol.min^{-1}} = \pu{0{,}125 U}a=2 min0 ,25μmol​=0 ,125μmol⋅min−1=0 ,125U
  • Volume de sérum analysé :
V=100 μL=1 ,0 ×10−4 LV = \pu{100 \mu L} = \pu{1{,}0 \times 10^{-4} L}V=100 μL=1 ,0×10−4L
  • Concentration d'activité catalytique du sérum :
b = \frac{\pu{0{,}125 U}}{\pu{1{,}0 \times 10^{-4} L}} = \pu{1{,}25 \times 10^3 U.L^{-1}}

La concentration d'activité catalytique est donc de 1250 U ⋅ L−1\pu{1250 U.L^{-1}}1250 U⋅L−1. Elle rapporte l'activité mesurée au volume de sérum prélevé, et non au volume total du milieu réactionnel.

En biologie clinique, les résultats sont le plus souvent exprimés en unité enzymatique par litre, notée U⋅L−1\mathrm{U \cdot L^{-1}}U⋅L−1.

Unités

Le katal, symbole kat\mathrm{kat}kat, est l'unité du Système international. Une activité de 1 kat\pu{1 kat}1 kat correspond à la transformation de 1 mol\pu{1 mol}1 mol de substrat par seconde.

L'unité enzymatique, symbole U\mathrm{U}U, correspond à la transformation de 1 μmol\pu{1 \mu mol}1 μmol de substrat par minute dans des conditions définies.

La conversion repose sur la relation suivante :

1 U=1 μmol1 minet1 U≈16 ,7 nkat\pu{1 U} = \frac{\pu{1 \mu mol}}{\pu{1 min}} \qquad \text{et} \qquad \pu{1 U} \approx \pu{16{,}7 nkat}1 U=1 min1 μmol​et1 U≈16 ,7nkat
Exemple

Convertir des unités enzymatiques en nanokatals

Un résultat de laboratoire est de 120 U ⋅ L−1\pu{120 U.L^{-1}}120 U⋅L−1.

La conversion en nanokatals par litre utilise l'approximation 1 U≈16 ,7 nkat\pu{1 U} \approx \pu{16{,}7 nkat}1 U≈16 ,7nkat :

120 U ⋅ L−1≈120×16 ,7 nkat ⋅ L−1=2004 nkat ⋅ L−1\pu{120 U.L^{-1}} \approx 120 \times \pu{16{,}7 nkat.L^{-1}} = \pu{2004 nkat.L^{-1}}120 U⋅L−1≈120×16 ,7nkat⋅L−1=2004 nkat⋅L−1

En arrondissant, le résultat vaut \pu{2{,}00 \times 10^3 nkat.L^{-1}}. Les deux écritures décrivent la même concentration d'activité catalytique, dans des unités différentes.

L'activité spécifique est l'activité catalytique rapportée à la masse totale de protéines de l'échantillon, souvent exprimée en U⋅mg−1\mathrm{U \cdot mg^{-1}}U⋅mg−1. Elle renseigne surtout sur le degré d'enrichissement d'une préparation enzymatique. Elle ne doit pas être confondue avec la concentration d'activité mesurée par litre de liquide biologique.

Attention

Activité et quantité d'enzyme

Une activité en U⋅L−1\mathrm{U \cdot L^{-1}}U⋅L−1 n'est pas une concentration molaire d'enzyme. La conversion en quantité d'enzyme n'est possible que si l'activité propre de la forme enzymatique et les conditions de mesure sont connues.

Principes analytiques

Mesure directe, indirecte et couplée

Une activité peut être déterminée en suivant :

  • la disparition du substrat ;
  • l'apparition du produit ;
  • la variation d'un signal physique associé à la réaction ;
  • une réaction auxiliaire transformant le produit en une espèce mesurable.

Dans une mesure continue, le signal est enregistré au cours du temps et sa pente fournit la vitesse de réaction. Dans une mesure en point final, la variation totale est mesurée après une durée fixée. La méthode continue permet de vérifier que la vitesse reste linéaire pendant l'intervalle retenu.

Une réaction couplée utilise une ou plusieurs enzymes auxiliaires lorsque la réaction étudiée ne produit pas directement de signal mesurable. Les réactions auxiliaires doivent être suffisamment rapides pour que la vitesse observée soit déterminée par l'enzyme recherchée et non par le système de détection.

La spectrophotométrie suit une variation d'absorbance. Son fondement optique est développé dans la fiche consacrée aux spectrométries.

Formule

Suivi spectrophotométrique d'une vitesse

dAdt=ε ℓ dcdt\frac{\mathrm{d}A}{\mathrm{d}t} = \varepsilon \, \ell \, \frac{\mathrm{d}c}{\mathrm{d}t}dtdA​=εℓdtdc​
  • AAA : absorbance, sans unité
  • ttt : temps
  • ε\varepsilonε : coefficient d'absorption molaire, en litre par mole et par unité de longueur
  • ℓ\ellℓ : trajet optique de la cuve
  • ccc : concentration de l'espèce absorbante, en moles par litre
Méthode

Mesurer une activité enzymatique

  1. Préparer un milieu réactionnel de composition, de pH et de température définis
  2. Introduire les substrats et les cofacteurs à des concentrations adaptées
  3. Ajouter l'échantillon contenant l'enzyme pour déclencher la réaction
  4. Suivre la variation d'un signal proportionnel au substrat consommé ou au produit formé
  5. Déterminer la pente dans la zone où la vitesse est linéaire
  6. Convertir cette vitesse en activité en tenant compte des volumes, de la stœchiométrie et de l'unité choisie

Paramètres influençant la mesure

Température et pH

L'augmentation de la température accélère d'abord les mouvements moléculaires et la fréquence des rencontres entre enzyme et substrat. Au-delà d'une certaine zone, elle déstabilise la structure tridimensionnelle de l'enzyme et diminue son activité. Toute valeur doit donc être associée à une température de mesure précise.

Le pH modifie l'état d'ionisation des acides aminés du site actif, du substrat et parfois des cofacteurs. Il peut aussi altérer les interactions qui stabilisent la structure de l'enzyme. Chaque méthode impose ainsi un domaine de pH défini.

Composition du milieu

L'activité observée dépend également :

  • de la concentration en substrat ;
  • de la présence des cofacteurs nécessaires ;
  • de la force ionique ;
  • de la nature et de la concentration du tampon ;
  • de la présence d'activateurs ou d'inhibiteurs ;
  • du rapport entre enzyme et substrat ;
  • de la durée de conservation de l'échantillon.

Pour mesurer l'activité enzymatique disponible plutôt que la disponibilité du substrat, celui-ci est généralement placé en excès. La vitesse dépend alors principalement de la quantité d'enzyme catalytiquement active, à condition que les autres constituants ne soient pas limitants.

L'hémolyse, une conservation inadéquate ou des cycles répétés de congélation et décongélation peuvent libérer des enzymes cellulaires ou en diminuer la stabilité. La phase préanalytique peut donc modifier le résultat avant même la réaction de dosage.

Standardisation et interprétation

Une activité enzymatique n'a de sens que si les conditions opératoires sont précisées. Des différences de température, de pH, de substrat ou de méthode produisent des valeurs qui ne sont pas directement comparables. Les intervalles de référence doivent être établis avec une méthode standardisée et une population de référence adaptée.

À retenir

Condition indispensable à la comparaison

Une activité enzymatique est une grandeur dépendante de la méthode. Deux résultats ne sont comparables que si les conditions de mesure, les unités et la procédure analytique sont compatibles.

Points clés
  • Une isoenzyme catalyse la même réaction qu'une autre forme enzymatique, mais possède une structure ou des propriétés distinctes
  • La distribution tissulaire des isoenzymes aide à préciser l'origine d'une augmentation d'activité circulante
  • L'activité catalytique mesure une quantité transformée par unité de temps, et non directement une concentration d'enzyme
  • Le katal correspond à une mole par seconde, tandis que l'unité enzymatique correspond à une micromole par minute
  • La température, le pH, la composition du milieu et la conservation de l'échantillon influencent l'activité mesurée
  • La comparaison des résultats exige des conditions analytiques standardisées

Fiches connexes

À réviser dans la foulée, sur Enzymologie.

  • Fiche 01Catalyse enzymatique, site actif et classification des enzymesEnzymologie
  • Fiche 02Cinétique michaélienne : Km, Vmax et représentations graphiquesEnzymologie
  • Fiche 03Inhibitions enzymatiques réversibles et irréversiblesEnzymologie
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