B2 · Acides aminés et protéines
Séparation et analyse des protéines
Présenter les méthodes de séparation des protéines fondées sur la charge, la taille ou l'affinité : électrophorèse, chromatographies. Introduire la spectrométrie de masse et l'exploitation d'un profil de séparation.
Biochimie structurale et métabolique7 min de lecture17 QCM corrigés
Principes généraux de la séparation
Un mélange protéique contient des molécules qui diffèrent par leur charge électrique, leur taille, leur forme et leur capacité à reconnaître un ligand. Une méthode de séparation exploite l’une de ces propriétés afin que les protéines ne migrent pas à la même vitesse ou ne soient pas retenues avec la même intensité.
Les propriétés acido-basiques et le point isoélectrique, noté , sont détaillés dans la fiche consacrée aux acides aminés. Il suffit ici de rappeler que la charge nette d’une protéine dépend du pH du milieu par rapport à son .
La séparation n’entraîne pas nécessairement l’identification. Une méthode peut montrer que plusieurs constituants sont présents sans déterminer leur nature, tandis qu’une méthode analytique complémentaire permet de les caractériser.
Électrophorèse des protéines
Principe de migration
Une protéine portant une charge nette se déplace vers l’électrode de signe opposé. Sa vitesse dépend de sa charge, des frottements exercés par le milieu et de l’intensité du champ électrique.
La mobilité augmente généralement avec la charge nette et diminue lorsque les frottements liés à la taille ou à la forme augmentent. Le support, souvent un gel poreux, limite les mouvements convectifs et peut également exercer un effet de tamisage.
Électrophorèse en conditions natives
En conditions natives, la structure tridimensionnelle et les associations entre sous-unités sont autant que possible conservées. La migration dépend donc simultanément de la charge, de la taille et de la forme. Cette méthode peut renseigner sur l’état d’association d’une protéine, mais une différence de migration ne peut pas être attribuée à un seul de ces paramètres.
Électrophorèse dénaturante en présence de dodécylsulfate de sodium
Le dodécylsulfate de sodium, ou SDS, est un détergent anionique qui dénature les protéines et se fixe le long de leur chaîne polypeptidique. Il masque largement les charges propres de la protéine et lui confère une charge négative approximativement proportionnelle à sa longueur.
Dans un gel de polyacrylamide, les protéines traitées par le SDS sont donc principalement séparées selon leur masse moléculaire apparente. Les petites chaînes traversent plus facilement les pores du gel et migrent davantage que les grandes. Un agent réducteur peut en outre rompre les ponts disulfure, ce qui sépare les chaînes polypeptidiques qui leur étaient reliées.
Focalisation isoélectrique et séparation bidimensionnelle
Lorsque le pH est différent du , la protéine possède une charge nette et migre. Lorsqu’elle atteint son , sa charge nette devient nulle et sa migration cesse. La focalisation isoélectrique sépare donc les protéines selon leur point isoélectrique.
L’électrophorèse bidimensionnelle associe deux séparations successives et indépendantes :
- une focalisation isoélectrique selon le ;
- une électrophorèse dénaturante selon la masse moléculaire apparente.
Chaque protéine apparaît alors sous forme d’une tache dont les deux coordonnées correspondent à ces deux propriétés.
Chromatographies des protéines
La phase stationnaire reste dans la colonne. La phase mobile, ou éluant, traverse la colonne et entraîne les protéines. Une protéine fortement retenue sort plus tard qu’une protéine faiblement retenue.
Chromatographie d’échange d’ions
La chromatographie d’échange d’ions sépare les protéines selon leur charge nette au pH choisi.
- Un échangeur d’anions porte des charges positives et retient les protéines chargées négativement.
- Un échangeur de cations porte des charges négatives et retient les protéines chargées positivement.
L’élution peut être obtenue en augmentant la concentration en ions de la phase mobile, car ceux-ci entrent en compétition avec les protéines pour les sites chargés. Une modification du pH peut également réduire ou inverser la charge nette des protéines et diminuer leur fixation.
Chromatographie d’exclusion stérique
Les grosses molécules pénètrent peu dans les pores et suivent un trajet court : elles sont éluées en premier. Les petites molécules explorent davantage le volume interne des billes et sortent plus tard. La séparation dépend du comportement de la protéine en solution, donc de sa taille mais aussi de sa forme et de son état d’association.
Cette chromatographie ne repose pas sur une fixation spécifique. Elle est généralement douce et permet aussi d’échanger le milieu dans lequel se trouve une protéine.
Chromatographie d’affinité
Les protéines ne reconnaissant pas le ligand traversent la colonne ou sont éliminées par lavage. La protéine reconnue reste fixée, puis elle est éluée en perturbant l’interaction, notamment par compétition ou par modification des conditions physicochimiques.
La forte sélectivité de cette interaction permet souvent une purification importante en une seule étape. Elle exige cependant de disposer d’un ligand approprié et de préserver la capacité de reconnaissance de la protéine.
Exploitation d’un profil de séparation
Un profil électrophorétique montre des bandes ou des taches. Leur position renseigne sur la mobilité, tandis que leur intensité reflète approximativement la quantité de matière détectée. Plusieurs bandes indiquent plusieurs espèces détectables, mais une seule bande ne prouve pas une pureté absolue, car des protéines différentes peuvent migrer ensemble.
Un chromatogramme représente un signal de détection en fonction du temps ou du volume d’élution. Chaque maximum constitue un pic chromatographique. La position du pic renseigne sur le comportement de la protéine dans le système, et son aire est reliée à la quantité détectée lorsque la réponse du détecteur est adaptée.
Introduction à la spectrométrie de masse
Le rapport masse sur charge est noté , où représente la masse de l’ion et le nombre de charges élémentaires qu’il porte. L’appareil comprend trois fonctions successives :
- ioniser les molécules sans perdre toute l’information structurale ;
- analyser les ions selon leur rapport ;
- détecter leur abondance afin de produire un spectre.
Les protéines peuvent être analysées intactes ou préalablement découpées en peptides par une protéase. Le spectre obtenu comporte des pics dont la position correspond à un rapport et dont l’intensité traduit l’abondance relative des ions détectés.
La spectrométrie de masse en tandem sélectionne un ion, le fragmente, puis analyse ses fragments. Les différences de masse entre fragments apportent une information sur la succession des acides aminés. La comparaison des masses mesurées avec des séquences théoriques permet d’identifier une protéine et de repérer certaines modifications post-traductionnelles.
La spectrométrie de masse complète donc les méthodes de séparation : l’électrophorèse ou la chromatographie réduit la complexité du mélange, puis l’analyse de masse contribue à attribuer une identité moléculaire aux constituants séparés.
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