B7 · Optique

Spectrométries optiques, fluorescence et oxymétrie de pouls

Décrire l'absorption d'un rayonnement par une solution et son exploitation quantitative. Présenter la fluorescence et l'application de la mesure d'absorption à l'oxymétrie de pouls.

Biophysique6 min de lecture17 QCM corrigés

Absorption optique d’une solution

La lumière transporte une énergie qui dépend de sa fréquence. Lorsqu’un rayonnement traverse une solution, il peut être transmis, absorbé, réfléchi ou diffusé. Les propriétés générales de la lumière et de sa propagation sont étudiées dans les fiches précédentes ; ici, seule la diminution d’intensité provoquée par l’absorption est exploitée quantitativement.

La probabilité d’absorption dépend donc de la longueur d’onde $\lambda$ , grandeur caractérisant la périodicité spatiale du rayonnement. Une molécule n’absorbe pas toutes les longueurs d’onde de la même manière : son absorption forme un spectre.

Lorsqu’un faisceau d’intensité incidente $I_0$ traverse l’échantillon, son intensité transmise $I$ est généralement inférieure à $I_0$ . Deux grandeurs sans unité décrivent cette atténuation.

La transmittance est la fraction de lumière qui traverse l’échantillon. L’absorbance augmente lorsque la transmission diminue. L’utilisation du logarithme transforme une atténuation multiplicative en une grandeur additive, ce qui permet notamment d’additionner les contributions de plusieurs espèces absorbantes indépendantes.

Loi de Beer-Lambert

Dans une solution homogène et suffisamment diluée, l’absorbance est proportionnelle à la concentration de l’espèce absorbante et à la distance parcourue par la lumière.

Le coefficient $\varepsilon(\lambda)$ exprime la capacité propre d’une espèce chimique à absorber à une longueur d’onde donnée. Il dépend aussi de l’environnement moléculaire, notamment du solvant, du pH et de l’état chimique du chromophore.

Pour plusieurs espèces absorbantes qui n’interagissent pas entre elles, les absorbances s’additionnent :

A(\lambda)=\sum_i \varepsilon_i(\lambda)\,\ell\,c_i

où l’indice $i$ désigne chaque espèce absorbante, $\varepsilon_i(\lambda)$ son coefficient d’extinction molaire et $c_i$ sa concentration.

Exemple

Déterminer une concentration par la loi de Beer-Lambert

Une solution contient un chromophore de coefficient d’extinction molaire $\varepsilon = \pu{1,50e4 L.mol^{-1}.cm^{-1}}$ à la longueur d’onde choisie. Elle est placée dans une cuve de trajet optique $\ell = \pu{1,00 cm}$ . L’absorbance mesurée est $A = 0{,}600$ .

La loi de Beer-Lambert donne :

c = \frac{A}{\varepsilon\ell} = \frac{0{,}600}{\pu{1,50e4 L.mol^{-1}.cm^{-1}} \times \pu{1,00 cm}} = \pu{4,00e-5 mol.L^{-1}}

La concentration du chromophore dans la solution est donc $\pu{4,00e-5 mol.L^{-1}}$ , soit $\pu{40,0 \mu mol.L^{-1}}$ .

Organisation d’une mesure spectrométrique

Un spectromètre d’absorption associe plusieurs éléments fonctionnels :

une source lumineuse émet le rayonnement ;
un dispositif de sélection spectrale isole une longueur d’onde ou un domaine étroit ;
le rayonnement traverse une cuve contenant l’échantillon ;
un détecteur convertit l’intensité lumineuse reçue en signal électrique ;
la comparaison avec une mesure de référence permet de calculer la transmittance puis l’absorbance.

La référence, souvent appelée blanc, contient tous les constituants sauf l’espèce à doser. Elle corrige l’absorption du solvant, de la cuve et des autres constituants non recherchés.

Les écarts à la linéarité peuvent provenir d’une concentration trop élevée, d’interactions entre molécules, d’un rayonnement insuffisamment monochromatique, d’une lumière parasite ou d’une modification chimique de l’espèce absorbante.

Fluorescence

Une molécule fluorescente, ou fluorophore, absorbe d’abord un photon. Elle atteint un état excité, puis perd une partie de son énergie par des processus non radiatifs. Elle émet ensuite un photon de fluorescence en revenant vers un état électronique inférieur.

Comme une partie de l’énergie a été dissipée avant l’émission, le photon émis possède généralement une énergie plus faible et une longueur d’onde plus grande que le photon absorbé. Ce décalage entre les spectres d’excitation et d’émission est appelé décalage de Stokes.

L’intensité de fluorescence dépend notamment :

de l’intensité du rayonnement excitateur ;
de la concentration du fluorophore ;
de son coefficient d’absorption à la longueur d’onde d’excitation ;
de son rendement quantique ;
des conditions physicochimiques du milieu.

À faible concentration, l’intensité émise peut être approximativement proportionnelle à la concentration. À concentration élevée, cette relation se dégrade car le rayonnement excitateur est absorbé avant de pénétrer profondément dans l’échantillon et parce que la lumière émise peut être réabsorbée.

Comparaison

Absorption et fluorescence

Critère	Spectrométrie d’absorption	Spectrométrie de fluorescence
Signal mesuré	diminution du rayonnement transmis	rayonnement émis par l’échantillon
Origine du signal	photons non transmis par absorption	photons émis après excitation
Longueur d’onde détectée	celle du rayonnement incident sélectionné	généralement supérieure à celle de l’excitation
Sensibilité	limitée par la mesure d’une différence d’intensités	souvent élevée car l’émission est détectée sur un fond faible

Oxymétrie de pouls

L’oxymétrie de pouls estime cette saturation de manière optique et non invasive. La valeur obtenue est notée $\mathrm{SpO_2}$ : il s’agit d’une estimation périphérique, à distinguer d’une mesure directe de la saturation artérielle.

Principe spectral

L’oxyhémoglobine, notée $\mathrm{HbO_2}$ , et la désoxyhémoglobine, notée $\mathrm{Hb}$ , possèdent des spectres d’absorption différents. L’appareil utilise donc deux longueurs d’onde, l’une dans le rouge, proche de $\pu{660 nm}$ , et l’autre dans l’infrarouge proche, autour de $\pu{940 nm}$ .

Dans le rouge, la désoxyhémoglobine absorbe davantage que l’oxyhémoglobine. Dans l’infrarouge proche, leur comportement relatif est inversé. La comparaison des atténuations aux deux longueurs d’onde permet ainsi d’estimer la proportion relative des deux formes.

Sélection du compartiment artériel

Les tissus, le sang veineux et le sang artériel absorbent tous la lumière. Cependant, seule la quantité de sang artériel varie nettement au rythme du pouls. Le signal optique comprend donc :

une composante continue, associée aux tissus et aux volumes sanguins peu variables ;
une composante pulsatile, associée principalement aux variations du volume artériel.

À chaque longueur d’onde, l’amplitude pulsatile est normalisée par la composante continue. L’appareil compare ensuite ces variations relatives.

La relation entre $R$ et $\mathrm{SpO_2}$ n’est pas déduite d’une application idéale de la loi de Beer-Lambert, car les tissus diffusent fortement la lumière et le trajet optique est complexe. Elle repose sur un étalonnage intégré à l’appareil.

La qualité de la mesure diminue lorsque la composante pulsatile est faible ou perturbée. Les mouvements, une perfusion périphérique insuffisante, la lumière ambiante, des pigments externes ou un mauvais positionnement du capteur peuvent altérer le signal.

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